检验标准化与量值溯源促进精准医学诊断的实现——访中国人民解放军总医院生化科主任颜光涛

　　近年来，随着人们对医疗服务的需求不断提升，“精准诊断”成为临床医生和科学家特别关注的议题。一方面，国家对“精准医疗”十分重视，所谓 “精准医疗”，即精准诊断和精准治疗，可以说精准诊断是实现精准医疗的前提;另一方面，我国体外诊断(in vitro diagnostic products，IVD)市场发展迅速，IVD行业逐渐得到资本市场的重视，IVD技术的进步势必会推进精准诊断时代的早日到来。在这样的大背景下，临床诊断领域受到了前所未有的重视。

　　近日，仪器信息网就精准诊断、国内IVD行业发展、检验医学标准化等热点话题采访了中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任/中国人民解放军总医院生化科主任颜光涛研究员,旨在帮助广大临床工作者深入了解我国临床诊断技术发展和应用情况。

中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任/解放军总医院生化科主任 颜光涛

精准诊断指导个体化治疗，获得最佳治疗效果和减少副作用

　　“精准医疗”是一个建立在了解个体基因、环境以及生活方式的基础上的新兴疾病治疗和预防方法。颜光涛解释到，“精准医疗的重点在精准，就比如打靶子，精准医疗的目标就是靠近疾病的靶心，提高准确率，降低副反应。对肿瘤患者来说，比经受多重化疗‘瞎子摸象’般地诊疗方式更能燃起对生命的信心，通过精准诊断获得个体化治疗方案，能使患者少受抗癌之苦，甚至能为患者赢得更多生存时间和治愈机会。”

　　通过精准诊断，可提升早期肿瘤患者疾病确诊率，获得对病变性质的精准判断，明确良恶性;对于中晚期癌症患者而言，对突变基因进行检测，可以确定治疗靶点。医生通过检测结果，为患者量身设计个体化治疗方案，使患者获得最大的治疗效果和最小的副作用，同时，也能节约医疗资源。

　　对遗传性疾病的早期诊断和干预，是精准诊断的另一个重要作用。颜光涛讲到，“疾病的预防其实比疾病的治疗更能造福人类，精准诊断技术的长足进步将使某些遗传相关性疾病得到很好的预防。比如：耳聋父母的基因检测能很大程度上降低耳聋患儿的出生率，BRCA1/2基因的检测能评估乳腺癌患者的直系女性亲属的乳腺癌发病可能性等等。”

全球范围内IVD领域是继临床治疗设备和药物之后技术进步最集中区域

　　随着全球经济的发展、人们保健意识的提高以及全球多数国家医疗保障政策的完善，全球IVD行业持续发展。2016 年，全球IVD行业市场规模约为617亿美元，预测未来几年内全球IVD行业将以约5%的年均复合增长率增长，并在2020 年达到747亿美元。颜光涛指出，“我国体外诊断行业处于行业生命周期中的成长阶段，人口老龄化、城镇化、人们健康意识的增强、政策的支持以及诊断技术的进步等因素都推动着行业的快速发展。”

　　海外欧美等发达经济体国家的体外诊断行业经过多年的发展，在技术、产品覆盖人群、人均消费水平等方面都大幅领先于我国。因而，通过对以欧美为主导的全球体外诊断行业的发展现状进行分析，无疑对理解我国体外诊断行业的未来发展趋势具有重要的参考意义。颜光涛介绍，“由于国外医疗制度较为完善，分级诊疗做得好，使得国外医疗检测机构分布范围广、区域覆盖面大，对先进的诊断产品和技术需求大，因此国外IVD产业发展包括市场、产品、技术都相对成熟。而目前我们国内问诊人群相对比较集中，人们还是倾向于去大医院看病。”

　　据了解，在我国国产IVD产品的市场份额仅占10%-15%，近90%的市场份额为罗氏、雅培等国外几家跨国公司所占有。对于这一现状，颜光涛给出了自己的看法，“我国IVD产业起步晚，市场分散，IVD企业少说上千家，整体技术水平和国外还有明显差距。而对医院和医生来说，身上所肩负的责任使得医生必须对产品质量，包括产品的稳定性、连续性和售后服务都有严格要求。在这种情况下，国产IVD企业目前这种处境也具有一定合理性。”但他相信，“随着一批国内领先的体外诊断企业在化学发光免疫诊断领域的不断创新和突破，在医改的大环境及政策推动下，国产化学发光产品将率先在城市三甲医院层面实现对进口产品的替代。”

　　作为一个多学科交叉、知识密集型的产业，技术进步始终是国内外IVD行业发展的重要驱动力。颜光涛讲到，“全球范围内IVD是在临床设备和治疗药物之后非常大的技术进步集中区域。”同时，我国IVD 行业细分领域众多，竞争激烈，参照海外经验，预计未来国内IVD行业市场集中度将大幅提升，积极实施外延并购的IVD细分龙头将由此受益。

化学发光免疫分析成为临床免疫理想的检测技术

　　目前临床开展的免疫检测技术有免疫荧光技术、放射免疫检测、免疫比浊技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫金胶体技术、化学发光免疫分析技术、均相免疫分析技术。另处还有临床PCR分子诊断、液态活检技术等也有广泛的临床应用。颜主任对这些主流技术逐一作了讲解。

　　免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体(或抗原)检测组织、细胞或血清中的相应抗原(或抗体)的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。荧光检测技术的发展，使得免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查IgM抗体，作为近期接触抗原的标志。利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的亚类。通过流式细胞仪，针对细胞表面不同抗原，可以同时使用多种不同的荧光抗体，对同一细胞进行多标记染色。

　　放射免疫检测技术是灵敏度较高的检测技术，利用放射性同素标记抗原(或抗体)，与相应抗体(或抗原)结合后，通过测定抗原抗体结合物的放射性检测结果，具有pg 级的灵敏度，且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用。

　　酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng 水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BAS-ELISA。

　　胶体金技术经过30 多年的发展到现在已日趋成熟，该方法是将二抗标记上胶体金颗粒，利用抗原抗体间的特异性反应，最终将胶体金标记的二抗吸附于渗滤膜上，此方法简单，快速，广泛应用于临床筛查。

　　化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学放光免疫分析仪继承了放射免疫的所有优点，同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点，是临床免疫检测目前较理想的方法。它在很大程度上巳取代放射免疫和酶联免疫成为临床免疫检测常规技术。

　　标本中的抗原与试剂抗体反应后，形成结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗体;测定两者之一即可计算出标本中抗原的含量。在一般情况下需将结合的(B)和游离的(F)分离后再进行测定，此为异相。在特殊情况下，B和F具有不同的特性，不必分离即可进行测定，此为均相。均相酶免疫测定包括酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种。

　　应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质。分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心技术是基因诊断，常规技术包括: (1)聚合酶链式反应(PCR); (2)DNA测序(DNA sequencing); (3)荧光原位杂交技术(FISH); (4)DNA印迹技术( DNA blotting );(5)单核苷酸多态性(SNP);(6)连接酶链反应(LCR);(7)基因芯片技术(gene chip)。其中，PCR产品占据目前分子诊断的主要市场，基因芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合了多种现代高精尖技术，被专家誉为诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大，目前产品种类很少，只用于科研和药物筛选等用途。

　　随着对肿瘤研究的深入，科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性，对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织，并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际;某些患者自身的情况决定了他不适合做组织活检;受到手术的扰动之后，有些肿瘤有加速转移的风险;组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。

　　液体活检技术的出现，解决了上述的问题，也提前了癌症的诊断时间。这也是液体活检技术被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”的原因。作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比高。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs)，循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片，循环RNA(Circulating RNA)和外泌体(携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等)。其中，ctDNA，RNA和外泌体是肿瘤细胞自身分泌或死亡时释放的物质。

中国人民解放军总医院生化科——亚太地区最大的临床自动化生化免疫检测实验室

标准化与量值溯源是当今检验医学发展的重要议题

　　标记免疫分析是当前生物检测中最为活跃、覆盖面最广、应用最为广泛的技术领域。是生命科学、基础与临床医学、农业与环境、食品与药物、进出口检疫检定、法医与刑侦等领域的关键性技术支撑平台。

　　标准化与量值溯源是当今检验医学发展的重要议题，涉及IVD行业的各相关领域，包含复杂的技术与管理问题。颜光涛作为中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任委员，一直致力于推动检验医学标准化与量值溯源工作，他表示，“标准化涉及多个层面，例如设备仪器标准化、工作流程标准化、产品规格标准化、项目操作标准化、人员培训标准化等等。标准化是一个非常系统化的工程，要求政府、企业和用户共同推进，这也是个缓慢的过程，但是局面相当紧迫。中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会为更好的推动我国检验医学标准化与量值溯源工作，充分发挥本协会专家资源的优势，通过建立基于我国医学参考实验室网络平台的标准化工作专家协作组(以单一项目为单位)和医学参考实验室协同研究组的协同研究方式，探索解决目前我国免疫类项目测量标准化的问题。首先以实现测量标准化为目的之uE3项目的协同研究为例，也希望各领域专家通力合作、相互沟通、相互理解、相互促进，在专委会这个公平、自由、开放的跨界交流平台上碰出火花，引领我国IVD行业大踏步迈向国际。”

　　对于相关工作进展，颜光涛进一步做介绍，“参考体系建设是一项浩大的工程，国际的经验是做好一个项目的标准化大约需数年时间。在杨振华教授的带领下我国参考体系建设已取得阶段性研究成果，主要表现在生化酶学、小分子代谢物项目的参考体系已经建立并在这些项目检验结果标准化方面发挥重要作用。免疫项目多、作用明确，标准化问题突出，临床需求明确。蛋白类物质很重要，但标准化难度相当大。特别高兴杨主任提出以uE3项目为切入点，大家用心做一定可以实现标准化，临床作用也特别大。陈文祥主任充分肯定了标免专委会把标准化工作作为协会的核心工作之一进行重点支持的大局意识。通过‘建立多种有效的合作方式，对共同性质问题进行专题讨论’的协同研究机制，相信能与当前国家对精准医疗的大力推进相互促进。提高我国精准诊断的水平。”

　　对于接下来的工作重心，颜光涛说，“下一步参考实验室的重点要从生化转向免疫项目，要总结参考实验室建设的经验，从uE3项目开始系统研究免疫项目标准化的路径。希望通过多个医学参考实验室 ‘协同研究’的方式研制我国的参考方法，通过医学参考实验室网络平台为参考物质赋值的方式，把我国的标准物质送进JCTLM列表。”

采访编辑：李博

颜光涛简历

　　颜光涛，男，1960年9月生，四川宜宾人。1983年毕业于华西医科大学医学系本科，在空军医专微生物免疫教研室任助教，1989年获军医进修学院硕士学位，1992-1994年曾赴挪威特图姆瑟大学作访问学者。从1993年任解放军第304医院创伤研究室副研究员，已从事生化教学及科研工作20年，研究方向为标记免疫分析技术、创伤后多器官衰竭的发病机理及神经系统损伤保护。曾任解放军总医院基础医学研究所副所长、生化研究室主任，军医进修学院生化教研室主任。现任生化科主任，研究员、临床检验教研室主任，博士研究生导师。已发表SCI收录论著28篇，总影响因子81.7，单篇论文最高影响因子6.398，Medline收录论文27篇，在国内统计源及核心期刊发表论文210余篇。现任中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主任委员。获军队科技进步二等奖3项第一作者。1996年获解放军总医院首届杰出青年基金奖，获首届军医进修学院“优秀学员奖学金”，解放军总医院“爱岗敬业优秀青年十佳标兵”并荣立三等功1次，总后勤部“科技新星”，2002年获国务院政府特殊津贴，2008年总医院首届研究型人材，首届解放军总医院十佳教师。

　　研究方向：

　　(1)标记免疫分析技术的建立和应用

　　已从事标记免疫分析技术的研发工作近20年，采用重组、多肽合成等方法制备Leptin、Orexin-A、Ghrelin抗原，免疫获取单克隆和多克隆抗体，在国内首先建立了高灵敏的Leptin、Orexin-A、Ghrelin等蛋白和多肽的分析方法，并在国内率先建立了人的系列炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10)的放射免疫、酶联免疫分析技术。并且在科研及临床研究中广泛应用。

　　(2) 脏器损伤及炎症反应的信号转导机制

　　在脏器损伤及炎症反应的信号转到机制的研究方面，在全军处于领先地位。以第一完成人先后获得1997年、2003年及2010年军队科技进步二等奖。分别是1)“磷脂酶A2激活和脏器功能损伤的机理研究”，证书号：97-2-149-1;2)“磷脂酶A2和炎性细胞因子在全身性炎症反应中的作用机理研究”，证书号：2003-2-72-1;3)“瘦素对创伤感染后多脏器功能的保护及机制研究”，证书号：2010-2-43-1。

　　(3) 神经系统疾病(脑缺血再灌注及神经退行性疾病)的保护及信号机制

　　在神经系统疾病的保护及信号机制的研究方面，正在全力研究当中，已在国际刊物上发表SCI文章4篇，最高单篇影响因子5.398，主要涉及leptin对脑缺血再灌注损伤的保护，leptin与阿尔茨海默病、帕金森症及癫痫等神经退行性疾病的关系等方面，后续研究正在进行中。