揭开癌症和免疫疾病背后的病毒病原学

　　尽管研究了几十年，但许多癌症的原因似乎很大程度上仍然是未解之谜。不过，也有一些类型的癌症，其恶性驱动因素已经被置于聚光灯下。科学家知道，99%的宫颈癌病例是由人乳头瘤病毒（HPV）引起的 1。HPV是一种大的DNA病毒，可在粘膜的角质化细胞、以及皮肤上形成感染，引起鳞状细胞乳头状瘤或疣。如果HPV是大多数宫颈癌的成因，那么它是否也会导致某些皮肤癌？

　　HPV和宫颈癌之间的密切关联引发了Emilie Hultin博士的好奇：HPV和非黑色素瘤皮肤癌之间是否也存在关联。作为瑞典卡罗林斯卡研究所的一名遗传学家，Hultin博士的HPV研究已经从芯片转移到新一代测序(NGS)，以揭示非黑色素瘤皮肤癌中存在的新型HPV。凭借Illumina的HiSeq®、MiSeq®和NextSeq®系统，她的研究凸显出NGS解决一部分医学上最大谜题的能力。

揭开HPV的秘密

　　Hultin博士的科学生涯是从瑞典斯德哥尔摩的皇家理工学院（KTH）开始的，她研究的是化学工程。在攻读博士期间，她致力于为开展基于芯片的SNP基因分型和HPV分型开发新的技术和方法。在工作了两年之后，Hultin博士于2011年加入卡罗林斯卡研究所。她目前是Joakim Dillner博士实验室的一名研究协调员，负责研究组的深度测序实验室。

　　Hultin和Dillner博士都对鉴定与各种人类疾病（特别是癌症）相关联的病毒很感兴趣。他们的工作主要集中在检测HPV和宫颈癌之间的致病关联。在生殖道中，某些类型的高危HPV病毒更有可能让宫颈细胞癌变，而低危的HPV病毒则仅限于引起生殖器疣。由于HPV也能感染皮肤，他们决定调查HPV-癌症的关联是否也包含非黑色素瘤皮肤癌。之所以将黑色素瘤排除在外，是因为它与日照有密切关联。

　　“我们知道皮肤上有许多HPV病毒株，但不敢肯定它们是否引起非黑色素瘤皮肤癌，”Hultin博士谈道。“要想确定关联的存在，需要鉴定皮肤样本中的少量HPV DNA。这不是一项轻松的任务。”

　　他们并不知道要寻找什么，因此他们在研究过程中使用了NGS。“芯片技术是针对已知的DNA序列，因此我们无法用它来鉴定新病毒，”Hultin博士说。“NGS让我们能对皮肤样本中的所有DNA进行测序，从而可以检测新型HPV。”

　　Hultin博士加入Dillner博士的实验室时，正赶上他们购买第一台NGS测序仪，Roche 454系统。研究团队后来使用一个中心实验室的Thermo Fisher Scientific Ion Torrent测序系统。不久他们认识到，这两台系统都不能提供寻找新病毒所需的测序深度。“病毒信号淹没在样本中极大量的皮肤细胞DNA中，”Hultin博士说。“实际上只有0.2%-0.5%的测序read是病毒DNA，其余都是人的。我们也需要一台可以同时进行多样本分析的测序系统，这样测序起来比较经济。如果每个测序运行只运行一个样本，这太奢侈了。”

MiSeq系统揭开皮肤中的HPV多样性

　　MiSeq系统则是一个完美的替代，既满足他们的深度测序要求，每次运行又能够分析96个样本。他们对MiSeq平台、454和Ion Torrent系统进行了逐项比较，想看看每个系统的表现如何。MiSeq系统成功做到了，与其他系统相比，它提供更多reads，测序深度高出其他测序系统1000倍。然而，这项研究还不仅仅是测序仪之间的对决。Hultin博士和她的团队利用这些系统开展了一系列研究，寻找了142个不同皮肤样本中的新型病毒，这些样本来自患有光化性角化病、基底和鳞状细胞癌的免疫抑制个体 2。

Emilie Hultin博士是瑞典卡罗林斯卡研究所的一名研究协调员

　　研究样本包含了全基因组扩增和PCR扩增的样本混合物。“对无偏好和偏好性样本混合物进行测序有一个优势，”Hultin博士说。“当我们对无偏好的全基因组扩增材料进行测序时，能够检测更多的HPV类型，但同时也得到大量人类序列。PCR扩增的样本让我们能够获得更多只含有HPV的序列。不过，我们也会错过一些类型的HPV，它们与我们使用的引物不匹配。”

　　两种样本的混合物需要用两种不同的Illumina文库制备试剂盒。“我们使用Nextera® DNA Library Preparation Kit来制备82个样本的全基因组扩增文库，只需要1-2天就能制备好所有样本的文库，”Hultin博士说。“在制备样本的同时可以对整块板进行分析是很方便的。”

“MiSeq系统鉴定出454和
Ion Torrent系统无法找到的HPV类型。”

　　“我们也使用经过特定PCR引物扩增的样本，形成约450 bp的扩增子，”Hultin博士补充道。“这个大小很合适，因此我们使用TruSeq® Nano DNA Library Preparation Kit来制备。我们跳过了片段化、末端修复和大小筛选的步骤，直接将测序接头与PCR产物的末端连接。Illumina的文库制备操作和MiSeq的流程大大减少了我们实验室的手动操作时间。”

　　这项研究发现了意想不到的多样性，至少有396种HPV包含之前未鉴定出的229种假定病毒。相比之下，早期在454和Ion Torrent系统上开展的测序研究鉴定出273种不同的HPV，其中只有47种未知病毒。

　　Hultin博士说：“之前认为，我们只会发现少量的几种新型的HPV，因为对皮肤HPV的研究不太多。但完全没想到皮肤HPV有着如此极端的多样性。MiSeq系统鉴定出了用454和Ion Torrent系统所没有找到的HPV类型。”

　　在使用454和Ion Torrent系统两年后，Hultin博士转到了MiSeq系统，这使她在研究上取得了更大的进展。“我们转到MiSeq系统之后，才达到我们所需的测序深度，并产生足以让我们鉴定出新型HPV的数据，”Hultin博士说。“这项研究的结果标志着我们对HPV多样性的认识有了根本的转变。”

短读长测序鉴定新型HPV

　　研究团队继续开展他们的研究，对血清、新鲜冷冻（FF）活检样本以及福尔马林固定、石蜡包埋的（FFPE）皮肤样本进行测序。由于FFPE样本中的DNA是高度降解的，他们认为较长的序列也许能更好地鉴定新型HPV。不过在实际研究中，他们发现读长较短的双端测序（151 bp）为FFPE样本带来了最好的结果。

　　利用HiSeq和MiSeq系统，Hultin博士领导了一项后续研究，在91个皮肤样本中寻找HPV，这些样本来自角化棘皮瘤、光化性角化病和基底细胞瘤，包含FF活检和FFPE样本 3。利用双序列标签在HiSeq系统上开展的多重、双端测序让他们能以一种无偏好性的方式对样本进行测序。他们发现四种过去未知的假定HPV类型，包括HPV197，它大量存在于不同的癌症样本中。HPV197与亲缘关系最近的HPV只有75%是相同的。它的引物区域存在许多核苷酸差异，这可能抑制了PCR扩增。

　　“如果不使用无偏好性的方法，HPV197将无法被发现，”Hultin博士说。“这种病毒大量存在于非黑色素瘤皮肤癌样本中，似乎是一种非常重要的皮肤HPV类型。”

向NextSeq 500系统的转变

　　2014年6月，Hultin博士在实验室中添置了一台NextSeq 500系统，并为其性能激动不已。研究团队发现，无论他们是否开展PCR扩增，NextSeq 500系统都是完美之选。“NextSeq 500系统让我们能高效测序FFPE样本，并通过FF活检样本组装新病毒，”Hultin博士说，“它带来了更高的测序深度以及测序96个样本混合物的能力。我们的研究大部分转移到NextSeq 500系统，只利用MiSeq系统进行验证或前期试验研究。”

　　研究团队的生物信息学pipeline是为双端测序的数据优化的。考虑到HPV这种病毒能够整合到宿主基因组中，NextSeq 500系统上的双端测序让Hultin博士能够鉴定病毒的整合位置。“我们可以在碱基对的水平上进行分析，看看这个碱基对是否对应这个病毒，以及下一碱基对是否对应到人类基因组，”Hultin博士这样解释。

“如果不使用无偏好性的方法，HPV197将无法被发现。”

　　Hultin博士对NextSeq 500系统的性能以及它的简单易用感到兴奋不已。“MiSeq系统的培训非常简单，我们想不到测序还可以更简单，”Hultin博士说。“之后，我们接受了NextSeq 500系统的培训，意识到Illumina确实让测序又变得轻松了很多。我们几乎不需要任何培训。”

癌症和免疫系统疾病的病毒病因学

　　NGS打开了一扇窗，让人们了解到存在的HPV病毒类型的数量。“几年前，我们只知道大约100种不同的HPV病毒类型，”Hultin博士指出。“而如今已经鉴定出200多种类型了。”

　　在HPV上获得的成功让研究人员能够更广泛地去了解病毒在癌症以及那些削弱免疫系统的疾病和紊乱中的作用。诺贝尔奖获得者、首个发现HPV作用的Harald zur Hausen博士提出，免疫抑制的个体更有可能患上由病毒引起的癌症，因为他们自身的免疫系统不再能够控制感染。艾滋病就是一个例子，患者患上非黑色素瘤皮肤癌的风险更高，如卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma）。

“NextSeq 500系统让我们能高效测序FFPE样本，并通过FF活检样本组装新病毒。”

　　Hultin博士及其团队一直在寻找与免疫抑制相关的癌症中的病毒特征，希望找到潜在的病毒关联。他们也在开展多发性硬化（MS）的研究，看看是否有病毒病因学的证据。Hultin博士已经得到了多发性硬化患者在诊断前几年采集的血清样本，以鉴定病毒是否与多发性硬化相关联。首次的NextSeq 500系统测序运行已经完成，研究正进入确认阶段。

　　尽管HPV在宫颈癌中的作用已逐渐清晰，但科学家对HPV及其他病毒在癌症发展中的作用的认识才刚刚开始。Hultin博士相信，更多类型的癌症可能有病毒病原学的证据，即使病毒感染不会自动地引起癌症。有了NGS的帮助，她相信最终能找到这些特征。

参考文献

1. Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol.1999;189:12–19.
2. Bzhalava D, Mühr LS, Lagheden C, et al. Deep sequencing extends the diversity of human papillomaviruses in human skin. Sci Rep. 2014; 4: 5807.
3. Arroyo Mühr LS, Hultin E, Bzhalava, et al. Human papillomavirus type 197 is commonly present in skin tumors. Int J Cancer, 2015; 136(11): 2546–2555.