“阵列”与“多维”的完美结合——访复旦大学化学系教授张祥民

　　色谱仪作为复杂物质的分离工具，在日常化合物的分离分析中发挥了巨大的作用，多数色谱仪属于一维色谱，适合于含几十至几百个物质的样品分析。随着现代科技的进步，传统的一维色谱分离方式已经不能满足人们对诸如天然产物、中药药物和蛋白质组等的常规分离，迫切需要更高效的分离方式来完成复杂样品精细分离的需要。因此，能够提供更大峰容量和更高分辨率的多维色谱技术日益受到人们的关注。相对于一维色谱分离而言，多维色谱分离具有更高的峰容量。从本质上说，多维色谱就是简单的一维色谱加复杂的阀切换技术。

　　目前，发展速度较快的多维色谱技术包括：全二维气相色谱、多维高效液相色谱、高效液相—毛细管电泳多维色谱、高效液相—气相多维色谱和多维超临界流体色谱等。近年来，国内外有些仪器公司陆续推出了一些多维色谱仪，但主要是二维色谱仪。例如岛津、沃特世、SCIEX、安捷伦和赛默飞等，其中赛默飞和SCIEX推出的二维液相色谱仪主要应用于蛋白质组的分析。安捷伦和沃特世推出的二维液相色谱仪，其使用主要集中在药物小分子的筛选。在已商品化的全二维气相色谱中，LECO 全二维气相色谱结合chromaTOF 软件，一次可解析大于100000个峰，降低了研究领域的谱峰解析难度。同时，国内色谱专家在阵列多维色谱系统的设计和应用上也有了杰出的研究成果。

　　近期，仪器信息网编辑就多维色谱目前发展状况、技术优势及未来产业化前景等内容与国内较早开始研究多维色谱技术的复旦大学化学系张祥民教授进行了深入的交流。

　　多维色谱破解蛋白组学研究密码

　　多维色谱技术包括二维色谱、三维色谱等高维色谱，近年来其应用越来越广泛。张祥民介绍，多维色谱不是简单的将每个柱子接起来。多维色谱指的是第一维分离出来数十到上百个馏分后，第二维相当于把第一维做出来的每个馏分再重新做一遍，以此类推。例如汽油，一维色谱可以分出来三、四百个组分，两维色谱其组分可以达数千，有学者曾用三维色谱去分，其组分可达六千多个。起初，张祥民教授团队提出用多维色谱技术来做中药成分分析。由于中药成分较为复杂，其中活性成分较难确定。通过多维色谱和高效毛细管电泳的结合，可以将中药里上千个馏分分离出来，这样就可以很好的鉴别不同中药里组分的活性和差异。复旦大学是最早建立多维色谱仪器系统并作为新技术手段用于解决实际问题的单位之一，这主要得益于复旦大学良好的仪器研发基础。

　　20世纪90年代，作为功能基因组学的重要支柱——蛋白质组学的出现，使得多维色谱的研究成为新的研究的热点。蛋白质组传统的研究方法是采用双向凝胶电泳分析。在双相凝胶电泳分析中，一维用来跑等电聚焦，另一维用来跑分子量，两维组合起来就可以将蛋白点分离出来。蛋白质组刚出来时几乎都在用这个方法做。双相凝胶电泳虽然可以分离出来几千个蛋白组分，但其工作量较大，难以实现自动化。张祥民谈到，起初其复旦大学研究团队使用双向电泳凝胶技术鉴定人肝中的蛋白质，团队三十几个人需要花费一两个月才能鉴定两千多个蛋白出来，过程中耗费了大量的人力和物力。现在采用多维色谱技术对蛋白质组进行分离鉴定一个人仅需要几个小时可鉴定5000-8000个蛋白，而且花费仅为数千元。多维色谱技术的突破迅速推动了生物医学难题的解决，例如重大疾病和各种癌症中的重大技术瓶颈问题。通过采用多维色谱技术可以寻找到一些关键蛋白质分子、疾病标志物和药靶蛋白，从而实现临床上的疾病诊断和新的治疗药物的发现。

　　目前，多维液相色谱技术已广泛的运用到由小分子到大分子的分离分析中，其商品化的色谱仪器日益完善。同时，研制我国自主知识产权的关键设备，开发相应的分离分析方法已成为当下值得关注的焦点之一，也是提高我国科技能力的一个重要方面。现阶段，尽管新技术新方法不断涌现，但是还不能完全满足实际应用的需要，尤其是缺少蛋白质组学中核心技术设备和应用于临床疾病研究的创新技术方法。然而，随着多维色谱分离技术的提高，分离方法不断进步，具有高通量高分离能力的多维色谱必将在蛋白质组学等领域发挥更大的作用。

　　国内多维色谱研究的开创者

　　张祥民于1986年进入中科院大连化学物理研究所工作，师从卢佩章院士和张玉奎院士。1994年张祥民进入复旦大学，从事博士后研究工作，后留复旦大学化学系工作至今。目前，张祥民为复旦大学化学系和复旦生物医学研究院双聘教授。还历任中国化学学会理事、中国化学会色谱专业委员会委员、中国色谱学会常务理事、中国分析仪器学会常务理事、中国蛋白质组学会理事、上海市分析测试协会副理事长, 并担任Proteomics, Anal Bioanal Chem (ABC)和《色谱》杂志编委等。

　　张祥民课题组是国内最早开始研究多维色谱技术的团队之一，其多项有关多维色谱技术的论文发表在国内外高水平的期刊杂志上。目前，张祥民课题组主要依托于复旦大学化学系、生物医学研究院和教育部创新科学仪器工程研究中心，课题组实验室共有三十余名科研人员从事多维色谱技术的研究。迄今为止，张祥民课题组累计发表SCI论文230多篇，申请发明专利50多项，获得2项教育部自然科学奖。

复旦大学化学系和复旦生物医学研究院双聘教授张祥民

　　从原理上对传统技术发起挑战

　　目前，国内分析仪器企业与国外公司相比体量还比较小，主要提供的是中低端仪器和量大面广的产品。因此，国内分析仪器生产企业对新型的仪器研发投入热情很高，但也存在心有余力不足的局面。上海市科委从“十五”到“十二五“一直对分析仪器行业有持续的资金投入，张祥民教授课题组参与承担了一系列仪器攻关项目研究，与企业开展产学研联合开发，先后与上海精科、舜宇恒平、上海天美等仪器公司合作，研发了十多种新型分析仪器，取得了一批创新技术成果。近年来国家开始逐步加大对国内分析仪器研发的支持力度，特别是“十二五“期间一些国家重大科学仪器开发专项资金的投入力度很大，一改研发资金不足的处境，这些资金的投入已经产出了大批先进的仪器和制造技术，相信国内分析仪器未来在仪器研发和创新上会有很大的发展和突破。张祥民谈到，“我们起初研发色谱仪器的想法很简单，主要是基于前沿研究课题需要和一些生产实际过程中的急需。因为商品仪器不能满足要求，在没有充足的购置经费时，创新便成为必要的选项。然而，创新色谱仪器的研制也不是想象的那么复杂，设计原理新、技术方案简单、成本低是前提，于是就根据需要自己搭建一套。“

　　发明的热膨胀泵就是典型的案例之一。色谱泵是色谱仪中运动部件最多，机械磨损最严重、较容易出故障的设备。色谱泵作为色谱仪的核心部件，其性能的好坏直接影响整个仪器和分离的可靠性。张祥民课题组研发的全新色谱泵——微流高压梯度热膨胀泵，采用一种全新的原理，其样机已成功应用于高效毛细管液相色谱与质谱联用仪器中，并得到安捷伦等国际企业研发机构的关注。由于液体具有热胀冷缩的特点，当温度升高时，毫升级密闭加热腔内液体体积就会有纳升到微升级的微小膨胀，从而溢出密闭加热腔，实现流量输出。热膨胀泵是以密闭腔体内液体受热体积膨胀为驱动力，从而实现流体定向输出。张祥民谈到，热膨胀泵的特别之处在于：从原理上还没有相关的商品化仪器。根据得到的理论方程，热膨胀泵只要精密控制好其温度和升温方式就可以保证过程中流量的恒流输出。热膨胀泵最大的优势是整机中几乎没有机械运动的部件，运行中听不到任何噪声，但其输出的压力却可以很高，可达到100 MPa。同时，热膨胀泵可以很好的避免传统泵中活塞杆、单向阀和密封环等部件在系统运行过程中损耗产生的费用，其成本比传统色谱仪低3~5倍。

　　“阵列”与“多维”的完美结合

　　阵列多维色谱仪研制的想法源于实验过程中的需要，是为实验而服务的。阵列多维色谱仪中的“阵列”代表着多通道和同时分离。2003年复旦大学蛋白质组研究团队购买了一台最快的TOF-TOF串联飞行时间质谱仪，其激光打谱的频率可以达到每秒两百张图，传统的多维色谱分离速度明显跟不上该仪器对蛋白质的鉴定需求。张祥民谈到，传统多维色谱遇到的最大问题是分析样品速度较慢，尽管目前已有超高压液相色谱，但总体来说分离速度还是受到限制。例如，从第一维色谱中分离出100个组分，如果每个组分分离需要1小时，那么第二维分离将达到100小时，时间太长。如果将多维色谱后一维做成阵列式，那么仪器运行过程就可以平行进行，从而使得效率成倍增加。基于此，张祥民课题组研制了一台18通道的阵列多维色谱仪，其分离速度提高18倍，可以与飞行时间质谱仪很好的进行匹配，大大缩短了实验过程中的分析时间。

图1. 阵列式多维液相色谱分离系统工作原理图。详见Anal. Chem. 2016, 88,2440-2445和《分析化学》 2015, 43: 1472-1478。(1) HPLC梯度泵;；（2）六通阀；(3)第一维分离柱；(4)紫外检测器；(5) 10通道顺序切换阀；(6）三通；（7）第二维阵列预柱；（8）8通道分流器；（9）第二维阵列分离柱；（10）96孔板。

　　目前，阵列多维色谱仪技术瓶颈问题已经得到解决。其中的关键技术已经在团队承担的国家973项目和国家863专项的实施过程中得到全面的发展、完善和实际应用。以刚刚完成开发工作的国际最先进的阵列式多维液相色谱仪器为例，张祥民教授的团队利用该仪器在人血浆高丰度蛋白去除方面取得了新的技术突破。这项成果于近日已发表在《Analytical Chemistry》上。

图2. 阵列多维液相色谱仪器系统。下图为阵列色谱系统照片，组件依次为第一维高效液相色谱泵，第二维高效液相色谱泵、阵列多维切换系统、阵列色谱柱组件，阵列馏分收集仪和系统自动化控制系统。上部分左边为阵列色谱捕集柱、分析柱及其连接流路，右边为阵列馏分收集系统结构图。

　　对于人血浆样品的蛋白组分析，一个重大挑战是大量高丰度蛋白存在掩盖了人们最感兴趣的低丰度蛋白的信号。为此，必须使用免疫亲和柱来处理血浆样品，利用抗体来捕获血浆中的高丰度蛋白，并将它们去除掉。但是，实验过程发现，去除高丰度蛋白的同时大量附着的低丰度的蛋白也一同被除掉。而且，目前这类商品化亲和柱最多只能去除20个高丰度蛋白质。为了解决这些问题，张祥民教授的团队研究开发了这台阵列式的多维色谱仪器，第一维采用阴离子交换色谱(SAX)，第二维采用8支反相液相色谱(RPLC)柱和8支蛋白捕集柱，开展了多循环并行分离。血浆高丰度蛋白的去除时间，由以往的一个星期缩短到四个小时，鉴定蛋白的浓度范围达9个数量级，一次可去除84个高丰度蛋白。与免疫亲和柱的方法相比较，获得蛋白质鉴定数量有大幅提高。在实际样品分析中，可鉴定出1332到1955个蛋白，包括一些丰度极低的膜体趋化因子、雄激素受体和肌苷脱氢酶等含量低至0.01 ng/mL的蛋白质。已经能够满足临床常见的疾病标志物甲胎蛋白(AFP)等标志分子检测需要。

　　阵列多维色谱仪市场还需培育，其应用前景广阔

　　在产业化过程中，阵列多维色谱仪也遇到的不少问题主要是市场的培育。由于阵列多维色谱技术比较新颖，因此前期需要市场培育和宣传，投入资金较多。此外，阵列多维色谱不像传统二维色谱可在线与质谱仪连接，它需要和高通量质谱联用匹配。但是，随着分析样品越来越复杂，高通量的阵列多维色谱仪将迎来快速发展阶段。张祥民谈到，例如多维色谱技术，出现好多年一直没有多少人去使用，近些年随着生命科学发展，需要解决的问题越来越复杂，特别是各种组学研究如蛋白组、代谢组等复杂体系的分离问题解决不了，因此多维色谱技术被派上大用场。阵列多维色谱也是这样，它的普及尚需要一个过程，但最后肯定会商品化，同时被广大用户所广泛使用。

                                                                                                               采访编辑：郭晓东