聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

一、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂在加速剂过硫酸铵或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶具有下列特性：

1. 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；

2. 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；

3. 对PH和温度变化较稳定；

4. 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；

5. 样品不易扩散且用量少；

6. 凝胶孔径可调节，根据被分离物的相对分子质量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；

7. 分辨率高。

    

血清蛋白在纸或醋酸纤维薄膜电泳中，只能分离出5~6条区带，而聚丙烯酰胺电泳却可分离出数十条区带，因而，目前PAGE已广泛用于科研、农、医及临床诊断的分析、制备，如蛋白质、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分离及病毒、细菌提取液的分离等。

二、实验用品

 （一）器材

（1）夹心式垂直板电泳槽和凝胶模。

（2）直流稳压电源。

（3）水泵或油泵，真空干燥器。

（4）移液管。

（二）试剂  

（1）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存，一般可保存1个月左右。

（2）分离胶缓冲液：取1mol/L 盐酸42ml，Tris36.6g,加重蒸水至80ml使其溶解，调PH8.9，然后用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶4℃贮存。

（3）浓缩胶缓冲液：取1mol/L 盐酸48ml，Tris5.98g加重蒸水至80ml，调PH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶内，4℃贮存。

（4）10%过硫酸胺：称AP1.0g,加重蒸水至10ml，当天配制。

（5）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶内，4℃贮存。

（6）Tris甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6g,甘氨酸28.8g，加蒸馏水至900ml，调PH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置试剂瓶中，4℃贮存，临用前稀释10倍。

（7）样品稀释液：浓缩胶缓冲液25ml+蔗糖10g+0.05%溴酚蓝5ml，用重蒸水定容至100ml，置试剂瓶中，4℃贮存。

（8）染色液：称取考马斯亮蓝R-250 50mg，溶于10ml冰乙酸，用重蒸水定容至100ml。

（9）脱色液：10%冰醋酸。

（10）保存液：甘油10ml，冰乙酸7ml,加水至100ml.

（三）材料

      新鲜血清（无溶血现象）。

三、实验程序

（一）操作方法

1.安装夹心式垂直板电泳槽

按说明书即可

2.配胶

本实验采用不连续体系，分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度为3%，交联度均为2.7%。

3.制备凝胶板

将混合后的分离溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1ml注射器在凝胶表面沿玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水用于隔绝空气，使胶面平整。

4.加样

作为分析用的PAGE加样量仅需几微克，2-3µl血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。取100µl血清用样品稀释液稀释至1ml。用微量进样器取25µl上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表形成样品层。待所有凹形样品槽内都加到了样品，即可开始电泳 。

5.电泳

将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶后，将电流调至20~30mA。当溴酚蓝染料迁移至距离硅胶框下缘1cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。旋松固定螺丝，取出硅胶框，用不锈钢铲轻轻将玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

6.固定和染色

为防止胶内已分离成分的扩散，需要进行固定，或浸泡在用7%乙酸液或12.5%三氯乙酸配置的染色液中，同时进行固定和染色，本实验固定和染色同时进行，使染色液没过胶板，染色1~2h，经常摇动，如水浴加热，可以缩短染色时间。

7.脱色

用10%乙酸浸泡漂洗数次，直到背景蓝色褪去。如用50℃水浴，则可缩短脱色时间。

8.制备凝胶干板

1mm以上的胶板常用凝胶真空器制备干板。如无此仪器可将脱色后的胶板浸泡在保存液中3~4h.制干板时在大培养皿上平放一块干净玻璃板，倒少许保存液在玻璃板上，使其均匀涂开，取一张预先用蒸馏水浸透的玻璃纸平铺在玻璃板上，赶走气泡，将四边多余的玻璃纸紧紧贴于玻璃板的背面。平放于桌上自然干燥1-2d，完全干后除去玻璃板，即可得到平整、透明的干胶板，此干板可长期保存，便于定量扫描。