等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点

实验原理

蛋白质是两性电解质，当Ph>PI时带负电荷，在电场作用下向正极移动；当PH<PI时带正电荷，在电场作用下向负极移动；当pH＝PI时净电荷为零，在电场作用下既不向正极也不向负极移动，此时Ph就是该蛋白质的等电点。

各种PH蛋白质的PI不同，利用各种蛋白质PI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自PI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的PH梯度。

在电场作用下，蛋白质在此PH梯度凝胶中泳动，当迁移到PH值等于PI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带，这种分离蛋白质的方法称为聚丙烯酰胺等电聚焦电泳。

聚丙烯酰胺等电聚焦电泳操作简单，电泳时间短，分辨率高。其应用范围广，可用于分离蛋白质及测定PI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究及动物分类等各种领域。随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又继而发展到超薄型水平板电泳等，还可与其他技术或SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率。

二、实验用品

（一）器材

（1）垂直管电泳槽和玻管。

（2）恒压恒流电泳仪。

（3）酸度计

（二）试剂  

（1）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

（2）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶内，4℃贮存。   

（3）5%过硫酸胺：称AP1.0g,加重蒸水至10ml，当天配制。

（4）电极缓冲液。

5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸，定容至1000ml。

2%NaOH溶液：称20gNaOH，溶于蒸馏水并定容至1000ml。

（5）两性电解质载体PH3~10。

（6）染色液：称取考马斯亮蓝R-250 50mg，溶于10ml冰乙酸，用重蒸水定容至100ml。

（7）脱色液：10%冰醋酸。

（8）40%蔗糖溶液：称取40g蔗糖溶于少量蒸馏水中，定容至100ml.

（三）材料

称取牛血清白蛋白7mg及牛胰核糖核酸酶5mg，共溶于1ml蒸馏水中，置冰箱备用。

三、实验程序

（一）操作方法

 1.凝胶柱的制备

预先准备洁净的玻管两根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中，使其垂直站立在桌面上或管架中。

将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3~5mm高，静止聚合30min,待凝胶与水层之间出现折射率不同的界面时，说明凝胶聚合，再放置0.5h，待聚合完全。

电泳

用手指压迫橡皮帽使其变形，让空气进入，小心地拨出玻管。倒出凝胶上层水 ，用滤纸吸干，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中，安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏。可以在槽中先加入5%磷酸缓冲液，检验是否漏液。再在下槽中装入2%NaOH溶液，把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，先调出电压至100V，待电压稳定后再升到300V，电泳2h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。

3、剥胶

电泳结束后，取下冷凝管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转运玻管，推针前进，同时注入水靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。

4.固定染色

取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液体中同时进行固定染色1~2h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。

pH梯度的制作

取另一条凝胶条放在玻板上，用尺贴近凝胶条，用干净的刀片，从凝胶的正极端开始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已编好号并装有1ml蒸馏水的试管中，浸泡过液。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。

蛋白质样品等电点的计算

  用下式求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：

固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离×（固定染色前凝胶条长度/固定染色凝胶条长度 ）

计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从PH梯度曲线上求出该蛋白质的等电点。