SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基相对分子质量

1. 实验原理

   SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是通过蛋白质和SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，不同大小分子迁移率不同，达到分离蛋白质的目的。

    

   在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。

    

在一定条件下，SDS与大多蛋白质的结合比为1.4g SDS :1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度一样，约为18Å，而长轴则随蛋白质的相对分子质量成正比地变化。由于蛋白质的迁移率与蛋白质的净电荷量成正比，与蛋白质在溶液中的摩尔系数成反比，而不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质相对分子质量的函数。

现在常用的SDS-PAGE系统有好几种，缓冲液系统有连续和不连续之分，凝胶形状可以是柱状，也可以是平板状。本实验采用的是不连续垂直板电泳，此系统分辨率高，便于电泳样品间的相互比较，是目前科研工作中广泛采用的一个系统。

二、实验用品

（一）器材

（1）垂直管电泳槽和玻管。

（2）恒压恒流电泳仪。

（3）酸度计

（二）试剂  

（1）标准蛋白质：可采用厂家生产的不同相对分子质量范围的SDS-PAGE标准蛋白质试剂盒，也可参考常用的标准蛋白质相对分子量表，从中选择3~5种蛋白质，按照每种蛋白0.5~1mg/ml溶解液，自己配制标准蛋白质混合试剂。

（2）凝胶贮液：丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

（3）10% SDS溶液:称5gSDS,加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。在低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

1. 电极缓冲液：称Tris6.0g,Gly28g,加10%SDS 10ml,加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

2. 样品溶解液：内含1%SDS,1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LPH6.7Tris.Hcl缓冲液。。

   （三）材料

   待测的已纯化的蛋白质样品。

    

   三、实验程序

   （一）操作方法

    1.凝胶柱的制备

   预先准备洁净的玻管两根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中，使其垂直站立在桌面上或管架中。

   将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3~5mm高，静止聚合30min,待凝胶与水层之间出现折射率不同的界面时，说明凝胶聚合，再放置0.5h，待聚合完全。

3. 凝胶板的制作

   将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm.用1ml注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水，用于隔绝空气，使胶面平整。约30min后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。用细长头的滴管将混合均匀的浓缩胶加到长、短玻璃板的窄缝内距玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。静置电泳槽，10min左右上胶即可聚合，再放置10~20min,加入PH８.３的Tris甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm,轻轻取出样品槽模板，即可加样。

   3、样品的处理

   根据标准相对分子质量蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，自己配制的标准及末知样品，按0.5~1mg/ml加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子，在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱保存较长时间，使用前在100℃沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合 。

    

   4.加样

   加样的体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10~15µL，若样品较稀，加样体积可达100µL，但注意样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡可用注射器针头挑除。加样时，将微量进样器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内尽量接近底部，注意针头不要碰破凹胶面，轻轻加入样品。由于样品溶解液中含有比较比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表面形成样品层 。

4. 电泳

    将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA,待样品进入分离胶后，将电流调至20~30mA,当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。

    

5. 染色与脱色

   电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放入大培养皿中，加入染色液染色1~2h，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。

    

6. 绘制标准曲线

   将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离，按下式计算相对迁移率mR：

    

     相对迁移率=蛋白样品距加样端迁移距离/溴酚蓝区带中心距加样端距离

    

   以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质相对分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准区线。根据末知蛋白质样品相对迁移率可直接从标准曲线上查出其相对分子质量。