自动化液质联用样品前处理：通过安捷伦 AssayMAP Bravo 平台实现高通量溶液内酶解和多肽纯化

摘要

适用于液质联用 (LC/MS) 分析的蛋白质和多肽样品前处理的工作流程由于依赖于连续的手工操作而效率低下，导致试验方案缺乏通量、可扩展性和可转移性。这类工作流程通常依赖于技能非常娴熟的从业人员以达到可接受的重现性，或者在很多情况下，鉴于工作流程的特殊性，较大的差异是可被勉强接受的。为解决这些问题，可以采用安捷伦 AssayMAP Bravo 平台及其蛋白质组学工具套件实现 LC/MS 蛋白质组学工作流程常规样品处理工作的自动化，使 LC/MS 样品前处理具有可重现性、可扩展性、方案可移植性和易用性。本平台由顶级的液体处理器、一次性微量色谱柱和简单的用户可定制方案组成，可高通量地进行蛋白质酶解和多肽纯化。BSA 经酶解后纯化所得的分析性能数据表明 25 种 BSA 目标多肽的日间重现性良好， % CV 小于 5% 此外，我们还展示了用于多肽纯化的 AssayMAP RP-S 和 C18 反相柱的所有特性。

前言

蛋白质和多肽分析经历了一场变革，部分原因是由于串联质谱、软电离技术、生物信息学和色谱分离技术的进步。分析革新和运算能力的融合，使科学家们得以利用液相色谱与质谱联用 (LC/MS) 的工作流程探索蛋白质动力学和具有空前灵敏度和精密度的定量测定方法。随着 LC/MS 在定量蛋白质组学领域的应用日益成熟，人们对分析精度的要求将更严格，对提高样品通量的愿望更强烈。然而，虽然 LC/MS 在蛋白质组学的应用已取得了巨大创新，但是样品前处理的发展未能与其它关键技术并驾齐驱。在生物标记物发现和验证领域，没有哪项技术像定量蛋白质组学的样品前处理技术一样发展得如此明显缓慢。据文献报道，利用 LC/MS 测定已揭示了数百种有关疾病的潜在蛋白质生物标记物并且记录在案。但是，其中绝大多数生物标记物的研究仍然止步于最初的使用一小组患者样品的研究。这些样品组通常比日常临床应用的分析验证所需的样品数少几个数量级。由于通过多步骤工作流程对患者样品进行单个或小批量处理会导致多重误差，因此在企图扩大样品处理规模时通常伴随着检测变异增大。这种变异会掩盖蛋白质表达中具有重大生物学意义的变化，初步研究表明，这些变化能够指示疾病的状态和易感性。

采用 LC/MS 进行定量蛋白质组学的样品前处理工作流程由于依赖于连续的手工操作而效率低下，导致试验方案缺乏通量、可扩展性和可转移性，而这些特性正是 LC/MS 临床应用和高通量筛选及过程控制工作流程所必须的。这些工作流程通常依赖于数量相对有限的技能相当娴熟的从业人员以达到可接受的重现性，虽然保持了所期望的分析质量，但却严重限制了增加样品处理容量的能力。能否成功利用 LC/MS 进行蛋白质分析，样品前处理的重现性非常重要。直观、可靠和样品可扩展的自动化方案的欠缺进一步限制了 LC/MS 在需要进行大量样品处理或要求高通量的分析中的应用。因此必须对样品前处理方法进行开发，使其能够从根据假说进行研究扩展至完整的临床验证和大规模检测。此类扩展能否实现取决于其所基于的自动化方案是否专门设计用于蛋白质样品前处理，重要的是能否满足蛋白质组学研究者们的需求。

本应用简报展示了专为实现可重现、可扩展并且简单易用的 LC/MS 样品前处理而设计的安捷伦 AssayMAP Bravo 自动化平台及其蛋白质组学工具套件。该平台包含配有 96 个探针式注射器的能够实现正向位移式精确流量控制的顶级液体处理器、一次性 5 μL 填充床色谱柱、灵活并且可自定义的分析方案以及简单的用户界面，可在微孔板中进行自动化的、高通量的蛋白质酶解和多肽纯化。本文将介绍 AssayMAP Bravo 在单一蛋白质模型系统的酶解和纯化中的应用，并报道了复合工作流程所得的分析性能数据。

结论

用于 LC/MS 样品前处理的安捷伦 AssayMAP Bravo 及其工具套件在一定程度上带来了自动化操作的重现性、可扩展性、灵活性并且简单易用，这是其它平台无法实现的。将此技术应用于定量蛋白质组学中常见而重要的样品前处理工作中，可最大程度缩短手动操作时间、实现通量最大化并轻松获得高精密度。溶液内酶解方案可实现平行处理 8-384 份样品，而多肽纯化方案可同时处理8-96 份样品。借助单个 AssayMAP Bravo 平台，这两种方案可轻松扩展至每周处理数十、数百、数千份样品。将 AssayMAP 的溶液内酶解和多肽纯化方案相结合，使用两种不同的变性剂进行试验并在多孔板上连续数天监测 BSA 的 25 种多肽所得的平均峰面积 % CV 在 2.3%-3.7% 范围之内。对 A ssayMAP RP-S 和 C18 反相柱所有特性的表征提供了其重要的性能数据，包括载样量、结合特性和 BSA 的胰蛋白酶酶解物的多肽回收率。弱至中等疏水性多肽在载样量低至 3 μg 时可获得良好回收率，同时，在亲水性极强的多肽被竞争性取代之前，可加载 100 μg 以上的 BSA 酶解物。