使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱对生物制剂进行灵敏的高通量体积排阻色谱 (SEC) 分析

摘要

单克隆抗体 (mAb) 可能会因细胞培养、收获、纯化、存储和填充期间的多种机制发生聚集。体积排阻色谱 (SEC) 是对 mAb 进行体积分离的标准方法。该方法被认为是用于定性和定量评估聚集体的强大参考技术。多种中间样品的 SEC 分析不仅需要数小时才能完成，而且在样品处于不利环境中时，还会极大地影响聚集状态。本研究证明了使用短柱长小孔径的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱对 mAb 和抗体药物偶联物 (ADC) 实现快速、高分离度、灵敏且可重现的分离和定量分析。分离和定量分析可在 4 min 内完成，更重要的是，该方法能够对应激条件下形成的聚集体进行监控与检测。

前言

蛋白质通常在暴露于应激条件下时发生聚集，例如 pH、温度或浓度的变化。不同生产阶段均有可能发生聚集，包括上游、下游或仅存储过程。体积排阻色谱 (SEC) 是一种用于监测和表征单克隆抗体 (mAb) 和抗体药物偶联物 (ADC) 聚集体的方法。然而，SEC 分离通常在相对较低的流速下采用较长色谱柱进行，分析时间通常较长。最近采用配备亚 2 μm 的超高性能液相色谱 (UHPLC) 来克服这些难题，结果表明分析时间大大缩短。然而，当应用非常细小的填料和较高流速时，热力和剪切力可能对于温度或压力敏感的蛋白质至关重要。此外，使用水性流动相对 ADC 进行 SEC 分析时得到了较差峰形，且聚集体和单体之间的分离度不合格。这些问题可能是疏水性细胞毒性药物和固定相之间的非特异性相互作用引起的。为解决这个问题并改善峰形，我们向 SEC 流动相中添加了多种有机改性剂。然而，这些有机改性剂可能会破坏蛋白质并缩短色谱柱的使用寿命。

安捷伦对 SEC 进行了多次改进，以提高所得信息的质量。其中，所开发的短柱长 (150 mm) 小孔径 (4.6 mm) 色谱柱与独特的亲水性聚合物涂层相结合，具有最佳孔隙体积和孔径。这些开发成果可确保色谱峰获得良好分离且峰形尖锐，而无需向水性流动相添加任何有机改性剂。本应用简报展示了应用短柱长小孔径的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱对 mAb 和 ADC 实现了快速的高通量 SEC 分析。本研究还展示了这款色谱柱在这些分子定量分析方面的应用。

结论

SEC 广泛用于蛋白质聚集体的表征。由于其具有潜在的免疫原性，因此重组蛋白质的生产过程中必须对聚集体浓度进行彻底控制。本研究证实了使用短柱长小孔径的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱（填料粒径 2.7 μm）可在 4 min 内对单体、聚集体和片段实现高通量分离。AdvanceBio SEC 色谱柱可为疏水性 ADC 提供出色的峰形，而无需在流动相中添加有机改性剂。该方法具有优异的峰面积和保留时间精度，表明其对于常规分析具有较高的可靠性。根据所评估浓度范围的线性相关系数值测得的结果，该方法可以实现准确定量。最后，短柱长小孔径的 AdvanceBio SEC 色谱柱能够根据强制应激研究可靠地监测聚集体和片段。以上结果表明这些色谱柱非常适用于需要高通量和高灵敏度的应用。