【知识分享】STORM技术在病毒研究中的应用

青春才几年？疫情就占了3年，全世界的科学家们都在竭尽所能的力图消灭新冠这个看不见的恶魔，但截至目前为止关于新冠病毒仍有许多的未知。

近年来国际上兴起的超高分辨率显微技术，则给科学家们提供了最新的成像手段用来获取病毒的更多细节，增加对病毒的了解，以帮助人们找到抑制或消灭病毒的方法。

本文借此分享一下STORM超高分辨显微技术在HIV-1 病毒、流感病毒和新冠病毒研究中所取得的一些进展。

01研究背景

单分子定位显微镜介绍

单分子定位显微成像技术 (SMLM) 是一类在特定物理或化学实验条件下，利用荧光染料随机闪烁（光开关）特性进行显微成像的技术。严格控制处于“开启”状态的荧光基团的数量，使得在任一时间点只有分布稀疏且超过衍射极限尺度的部分荧光基团可以发光。因此，可以通过宽场成像记录这些单个荧光基团的空间分布（图 1）。随机光学重构显微镜 (STORM)的作为SMLM技术的典型代表，其采用光可切换探针标记到单个目标分子，通过拟合高斯光斑轮廓对单个分子发光的中心点进行精确定位，从而实现超高分辨率，以 20 nm 的定位精度重建图像。

图1.抗体标记病毒的STORM成像示意图

病毒颗粒固定在载玻片上，并用针对特定蛋白质的荧光抗体染色。全内反射荧光 (TIRF) 成像提供了病毒颗粒的衍射限制图像。通过记录荧光基团的“闪烁”并在采集的每一帧中获得它们的精确定位来实现增强的分辨率。所有帧的单个定位用于重建“超分辨率”图像。

02应用实例

STORM在HIV-1病毒体结构研究中的应用

超高分辨率显微镜的使用能够加深对 HIV 生命周期各个阶段的理解，包括病毒组装、释放、结构和成熟、细胞间运输和进入细胞。单个 HIV-1 颗粒2D 和 3D STORM成像， 证实了 Env 糖蛋白在成熟病毒体的膜中形成簇，宿主的抗病毒因子丝氨酸整合蛋白 5 (SERINC5) 可以破坏Env簇，可能会中断病毒的融合。

利用STORM 成像比较了游离病毒颗粒 HIV-1 基质壳和衣壳核心与刚刚进入宿主细胞的颗粒的尺寸，通过使用基因编码标签标记整合酶或辅助 Vpr 蛋白，或使用针对 CA、MA 或 gp120 蛋白的抗体来获得有关 HIV-1 病毒颗粒尺寸的高分辨率信息。展示了STORM在研究病毒颗粒在成熟过程中内部结构重排起始和动力学方面具有相当大的潜力。

03STORM在流感病毒结构研究中的应用

使用STORM观察到：流感病毒颗粒被脂质双层包围，其中嵌入了两种表面糖蛋白，即血凝素(HA) 和神经氨酸酶(NA)。脂质双层下面是结构基质蛋白(M1)，它形成一个核心，其中包含 8个病毒 RNA片段，每个片段都与多个核蛋白(NP) 和RNA 聚合酶结合，形成核糖核蛋白(RNP) 复合物。除了这些相似之处，流感病毒颗粒在尺寸和形状上具有高度的多形性，从直径约 100 nm 的球形病毒颗粒到长度达到数微米的细丝不等。

图2流感病毒结构

A&B) 球形和丝状流感病毒的示意图。HA–血凝素，NA–神经氨酸酶，M1–基质蛋白1，M2–基质蛋白 2（离子通道）， RNP–核糖核蛋白。C) 用 A/Udorn/72 病毒感染并染色 NA 的 MDCK 细胞的 STORM 图像，显示从细胞中出现的长病毒丝。比例尺 10 μm。D) 纯化的A/Udorn/72细丝和球体的 STORM 图像，HA染色。比例尺 2 μm。E) 单个 A/Udorn/72 球形病毒粒子的 STORM 图像，NA 染色为绿色，HA 染色为紫色。比例尺100 nm。STORM 图片来源：牛津大学的 Andrew McMahon

04STORM在SARS-CoV-2(Covid-19的病原体）研究中的应用

超高分辨率显微镜也是新型人类冠状病毒研究的重要工具。用STORM可以看到，SARS-CoV-2 形成直径从 50 到 200 nm 的球形病毒颗粒，其中包含四种结构蛋白，即刺突 (S)、包膜 (E)、膜 (M) 和核衣壳(N)（图 3 A和B）。S是一种约 180 kDa 的糖蛋白，作为同源三聚体从病毒表面突出（图 3 C）并介导病毒与细胞膜受体的结合ACE2。感染 SARS-CoV-2 后，病毒会触发复制细胞器 (RO) 的生物发生，例如受感染细胞中的双膜囊泡 (DMV)，从而保护病毒 RNA在复制过程中不被降解。病毒病毒粒子的组装发生在内质网(ER) 到高尔基中间区室 (ERGIC)，然后通过 Arl8b 依赖性溶酶体胞吐作用进入溶酶体并进入细胞外环境。通过STORM 成像关注到受感染细胞的基底膜平面来研究单个病毒粒子在其进入和离开过程中的大小，并证明网格蛋白的作用囊泡，而不是caveolin-1，作为病毒从细胞表面到早期内体的主要载体。ExM 和光片显微镜的组合用于研究四种结构 SARS-CoV-2 蛋白的表达动力学和空间排列，证明 N 蛋白与 RO 的关联并允许可视化病毒诱导的宿主形态变化细胞结构。

图3. SARS-CoV-2病毒结构

A) SARS-CoV-2 病毒粒子的示意图。B) 固定 SARS-CoV-2 颗粒的 STORM 图像，核衣壳染色为绿色，尖刺染色为紫色。比例尺 5 μm。C) 单个病毒粒子的 STORM 图像，核衣壳染色为绿色，尖刺染色为紫色。比例尺 100 nm。STORM 图片来源：牛津大学的 Andrew McMahon

STORM弥补了电子显微镜对于病毒空间信息的不足，使病毒的结构能够以纳米尺度的分辨率实现可视化，为我们提供了对病毒结构、形态和生物学的认识。当今社会新冠病毒肆虐，SARS-CoV-2 病毒构成的直接威胁，这使STORM为解决 SARS-CoV-2 蛋白与宿主细胞蛋白 SARS-CoV-2 相互作用的问题，细胞内的复制动态，以及 SARS-CoV-2 在感染细胞内复制的确切位点提供了有用的工具。

此外，STORM同样可用于了解其他现有或新出现病毒、病原体的，结构是怎样的、如何组装以及如何与宿主细胞相互作用的研究，并指导制定抗病毒抑制剂和疫苗的策略。