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【知识分享】超分辨显微镜显示神经元突触两侧存在γ-分泌酶（预约试拍）

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2022/12/06 17:59

阅读：14

跨膜蛋白装配γ-分泌酶是约100种1型跨膜蛋白的受调控膜内加工（RIP）中的关键蛋白酶。重要的是，它在阿尔茨海默病（AD）中具有病理作用，因为它从淀粉样前体蛋白（APP）生成神经毒性淀粉样β肽。因此，从生物学和治疗学的角度来看，γ-分泌酶的定位研究都是至关重要的。

尽管在许多实验室中进行了几年的努力，目前尚不清楚γ-分泌酶在神经元中的何处发挥其活性。其中技术挑战之一是，活性酶含有四种蛋白质组分，并且大多数亚细胞区室不能通过传统光学显微镜进行空间分辨。

研究介绍(节选)

γ-分泌酶是阿尔茨海默病（AD）病理学中的关键角色，因为它催化淀粉样前体蛋白（APP）加工的最后一步，导致神经毒性淀粉样β-肽（Aβ）的形成，Aβ是AD患者大脑中淀粉样斑块的主要成分。γ-分泌酶产生长度可变的Aβ，尤其是42和43个氨基酸的变体（Aβ42和Aβ43）易于形成神经毒性寡聚体。AD患者海马神经元中Aβ42的细胞内水平升高，在突触中蓄积，并与AD病理学相关。直接抑制γ-分泌酶作为AD的治疗策略是复杂的，因为除APP外，该酶还有大约100种不同的底物，包括Notch。重要的是，已证明Aβ是在突触处产生的，这是在突触前还是突触后发生的还存在争议。这种不确定性部分是由于确定突触亚结构所涉及的技术挑战。

在这里，作者使用了两种纳米技术STORM和STED显微镜的强大组合来可视化γ-分泌酶在神经元中的位置。作者发现γ-分泌酶存在于突触前和突触后区室。研究中，作者进一步表明该酶在突触后膜中非常接近突触间隙处富集，以及NMDA受体表明γ-分泌酶存在于突触后质膜。研究中，作者以高精度的数据显示了突触的三维位置，并解决了长期以来关于γ-分泌酶突触位置的争论。

研究结果(节选)

共聚焦显微镜显示，树突形成了几个突触，轴突与树突平行或在树突之间延伸（图1a），在轴突和树突中都发现了γ-分泌酶，并在突触中富集（图1a）。PS1和nicastrin的染色显示，这些成分与GTB在相同的区域，也在其他区域发现（图1b和c）。在单独生长的轴突中，即在很大程度上与树突分离的轴突中，γ-分泌酶富集在前扣突结构中（图1d）。这种酶也在轴突末端突触中富集（图1d）。γ-分泌酶的STED图像，与作为轴突标记物的Tau蛋白共同标记，进一步证实γ-分泌酶在前结中富集，并且显示γ-分泌酶染色在前结的外部最强（图1e）。通过STORM图像进一步证实了γ-分泌酶在棘上的富集，其中γ-分泌酶被GTB和Alexa 647标记的链霉亲和素染色（图1f）。因此，三种不同的显微镜技术显示γ-分泌酶在神经元突触处富集。

图1 通过dSTORM等分析小鼠原代海马神经元轴突、树突和棘中γ-分泌酶的定位。

(a)MAP 2染色（蓝色）、tau（绿色）和γ-分泌酶（红色）染色的周围轴突的放大树突的共焦图像。如图所示，在上部面板中显示各个污渍，而在下部面板中显示合并图像的不同组合。(b)树突特写中PS1和γ-分泌酶标记的共聚焦图像。箭头指向PS1和γ-分泌酶共染色的突触区域（黄色）。(c)树突特写中PS1和nicastrin标记的共聚焦图像。箭头指向突触区，同时染色的是nicastrin和γ-分泌酶（黄色）。(d)共焦图像相同的细胞的轴突与τ(a)染色在绿色上面板,γ-secretase红色中间面板和合并后的图像在底部面板。合并后的形象的插图显示了一个放大部分的MAP2(蓝色)。(e)结合共聚焦显微镜和STED显微镜（γ-分泌酶，中图）观察轴突结中活性γ-分泌酶的富集。底部面板中显示合并图像。(f)活性γ-分泌酶（红色）的dSTORM图像与明场图像重叠。注意棘上活性γ-分泌酶的富集。

γ-分泌酶在突触处的富集使我们研究该酶是否存在于突触前或突触后区室中，这些区室由仅20-25nm宽的裂隙隔开。这个距离比传统共聚焦显微镜获得的分辨率小10倍左右，因此STORM被用于更好地显示突触位置。由于我们用STORM进行成像，因此我们可以从不同角度研究突触素和γ-分泌酶的分布（图2a）。γ-分泌酶和突触囊泡蛋白之间的接近度从各个角度都很明显，在某些情况下，突触囊泡蛋白和γ-分泌酶信号之间的距离小于10nm。

图2 突触中γ-分泌酶的STORM成像

(a)活性γ-分泌酶在突触前区的定位显示γ-分泌酶（红色）和突触前标记突触囊泡蛋白（蓝色）。左上方的面板显示了典型的STORM图像，左侧为明场叠加，中间和右侧面板放大，右侧显示了单个突触区域。下图从三个不同角度显示了在3D视图中显示的相同突触，其中红色、绿色和蓝色线分别表示X、Y和Z方向。(b)活性γ-分泌酶在突触后区的定位，显示γ-分泌酶（红色）和突触后标记物PSD 95（蓝色）。左上方的面板显示了典型的STORM图像，位于左侧的明场覆盖图上，中间和右侧面板的放大倍数增加。下面板从三个不同角度显示了3D视图中显示的同一突触，其中符号中的红色、绿色和蓝色线分别表示X、Y和Z方向。

突触后密度和突触间隙之间的距离表明γ-分泌酶在突触后质膜中富集（图5a-e）。STORM分析显示NMDAR2B和γ-分泌酶之间非常接近，这为突触后膜中存在γ-分泌酶提供了进一步的证据（图3）。

图3 γ-分泌酶在突触后质膜的定位

(a)STED图像显示γ-分泌酶（红色）非常靠近树突棘中的突触间隙（白色箭头）。突触素（蓝色）和PSD95（绿色）分别标记突触前和突触后侧。(b)γ-分泌酶（红色）和NMDAR 2B（绿色）的STORM成像。(c)与（b）中的右图相同的突触后膜区域从三个不同角度显示在3D视图中，其中红色、绿色和蓝色线分别表示X、Y和Z方向。

通过以上研究结果，作者发现γ-分泌酶主要存在于突触前区室的细胞内细胞器中，而在突触后区室的细胞内细胞器和质膜中都有发现。突触前和突触后区室中的丰度随着突触的成熟而增加。作者的研究结果表明，Aβ可以在突触前和突触后区室产生。因此，本研究对于进一步了解AD病理学具有重要意义，这与未来创建开发AD治疗的新方法密切相关。

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参考文献

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