Caspase-6活性测定试剂盒 比色法

Caspase-6 活性检测试剂盒说明书

比色法

规格：20T/18S、50T/48S、100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：分装-20℃保存。

2、 试剂二：分装-20℃保存。

3、 标准品：pNA 标准溶液，5 mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。

4、 标准品稀释液配制：取 9 mL 试剂一加入 1 mL 试剂二，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二=9:1的比例，自行配制）。

产品说明：

Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含 10 多个成员。Caspase-6 也称 Mch-2，其前体蛋白被 granzyme B 剪切后形成活化的 caspase-6 二聚体，可诱导细胞凋亡。Caspase-6 可剪切凋亡的关键调节蛋白 PARP，剪切核膜上关键蛋白 Lamin A，其对于 Lamin A 的识别位点是 VEID。

本 试 剂 盒 测 定 原 理 基 于 Caspase-6 特 异 水 解 其 多 肽 底 物 Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-pnitroanilide)，释放出游离的硝基苯胺 pNA，后者呈黄色在 405 nm 具有最大吸收峰，采用可见光光度比色法测定。其吸光度值对应于 Caspase-6 的水解活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、100μL 玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约 10⁶个）加 100 μL 试剂二（若裂解不充分可提高至 150-200 μL），震荡重悬沉淀，置冰上静置 15 min，4℃，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 试剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置 15 min，4℃，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

2、 临用前用标准品稀释液将 5 mmol/L pNA 标准品稀释至 200、100、50、25、12.5、0μmol/L 的标准溶液待用。

3、 样本测定（在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂）

三、Caspase-6 活性计算

1. 标准曲线的建立：

根据标准管的浓度（x，μmol/L）和 ΔA 标准（y，减去浓度为 0 的空白管）做标准方程。将 ΔA 测定代入标准方程得到 x（μmol/L）。

2. 按酶活性增加百分比计算

Caspase-6 活性增加百分比=（实验处理组 A 测定-A 空白管）/（实验对照组 A 测定-A 空白管）×100%该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。

3. 按酶活计算

caspase 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底

物饱和时，在 37℃一个小时内可以剪切 1nmol pNA 底物产生 1nmol 游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。

Caspase-6 活性（U/mg prot）=x×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V 反总：反应体系总体积，0.1mL=10^-4L；V 样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

注意事项：

1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样品用水稀释 2 倍后，用 Bradford 法测定蛋白浓度，以降低 DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用 BCA 法测定蛋白浓度。

2、Caspase 活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0、2、4、8、16、24 小时，以检测最佳的观察点。

3、所测样本的值高于标准曲线上限时，可用试剂二稀释样本后重新测定。

4、盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。37 oC 孵育，肉眼可见颜色变黄时的 OD405 值约为 0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！