单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂二:临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解,4℃保存;
2、试剂三:临用前加入 3.33 mL 蒸馏水充分溶解待用,可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融;
3、试剂四:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加 2 mL 试剂一充分溶解,可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
产品说明:
MDHAR催化MDHA还原生成AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。
MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500-1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min);然后 10000rpm,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一在25℃水浴锅中预热30min。
3、 依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂
三、MDHAR 活性计算
实验实例:
1、 取 0.1g 橙子果肉加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8701-0.8396=0.0305,ΔA 空白管=A1 空白-A2空白=0.5515-0.5474=0.0041,按样本质量计算酶活得:
MDHAR (U/g 质量) =0.268×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W=0.268×(0.0305-0.0041)÷0.1=0.070752 U/g 质量。
注意事项:
1. 当 ΔA 测定大于 0.3 时(96 孔板 ΔA 测定大于 0.2),建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例(如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 600μL 试剂一+100μL 上清液)后进行测定。
2. 当 ΔA 测定过小时,建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例(如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 200μL 试剂一+500μL 上清液)。
3. 当 A1 大于 1.5 时(酶标仪测定时 A1 大于 2 时),建议将样本稀释进行测定。
4. 空白管为检测各管试剂组份的检测孔,正常情况下,其 OD 值在 0.5 左右(96 孔板在 0.3 左右),变化不超过 0.01。
5. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!