纤维素(CLL)含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/50d59454-361c-4bc9-a290-5c29f058714c.jpg)
溶液的配制:
1、 提取液一:80%乙醇 200 mL,即将 160 mL 无水乙醇和 40 mL 蒸馏水混合,自备。提供一个 125 mL 空瓶。
2、 标准品:10 mg 葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,2-8℃保存两周。
3、 工作液的配制:取一瓶试剂一中加入 2.5 mL 试剂二,充分混匀,如较难溶解,可充分震荡或加热搅拌;用不完的试剂可以 2-8℃保存一周。
产品说明:
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以 β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体,通常与半纤维素、果胶及木质素结合在一起,是植物细胞壁的主要结构成分。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、炸药、电工及科研器材等领域。
纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。在强酸作用条件下利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/338578bc-00c8-4610-9a7e-071ec5a8063a.jpg)
技术指标:
最 低检出限:0.0023 mg/mL
线性范围:0.003125-0.09 mg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、丙酮、浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水和EP管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细胞壁物质(CWM)的提取:
(1) 称取约 0.3g(记为 W1)样本,加入 1mL 提取液一,室温快速匀浆,90℃水浴 20min,冷却至室温,6000g,25℃离心 10min,弃上清。
(2) 沉淀先后用 1.5mL 提取液一和丙酮各洗两遍(涡旋振荡 2min 左右,6000g,25℃离心 10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁。
(3) 在粗细胞壁中加入 1mL 提取液二(去除淀粉)浸泡 15 小时,6000g,25℃离心 10min,弃上清,将沉淀用蒸馏水清洗两遍(涡旋振荡 2min 左右,6000g,25℃离心 10min,弃上清即可),之后干燥沉淀(60-100℃均可),得到细胞壁物质(CWM),称重记为 W2。
2、 纤维素的提取:
(1) 称取烘干的 CWM 约 5mg(记为 W3),加入 0.5mL 蒸馏水充分匀浆,匀浆液转移至 EP 管中,用蒸馏水定容至 0.5mL。
(2) 将定容后的匀浆液置于冰水混合物中,缓慢加入 0.75mL 浓硫酸,缓慢混匀,冰水浴中静置 30min。8000g,4℃离心 10min,取上清液,用蒸馏水稀释 20 倍后待测。
注意:1. 若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬,可以先研碎再进行后续步骤
2. 在提取纤维素的过程中,首先,置于冰水浴中的 EP 管需要固定,不要上下左右浮动,一方面保障自身安全,另一方面防止冰水混合物进入 EP 管造成试验误差;再者,加入浓硫酸时,建议枪头伸入样本液面以下,缓慢加入,防止液面沸腾及样本碳化。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至620nm,蒸馏水调零。
2、 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.09、0.08、0.07、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液备用。
3、 标准品稀释表
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/09af17dd-3123-47cc-92cd-eb7d3e61b727.jpg)
4、 操作表 (在1.5mL离心管中) :
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/b8e48b50-17bb-447c-a04e-e72721076292.jpg)
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/ab0dc4bf-138b-4504-b299-6bde90527361.jpg)
三、纤维素含量计算
1、标准曲线的绘制:
根据标准管的浓度(x,mg/mL)和吸光度ΔA标准(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA(y,
ΔA)带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)
2、纤维素含量的计算:
(1)按样本质量计算
纤维素(mg/g 质量)=x×V提取×20×(W2÷W3)÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
(2)按样本细胞壁物质(CWM)质量计算
纤维素(mg/g干重)=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11:是此法测得葡萄糖含量换算为纤维素含量的常数,即111 μg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100μg纤维素蒽酮试剂所显示的颜色;V提取:纤维素提取液体积,1.25mL(0.5mL蒸馏水+0.75mL浓硫酸);20:样本稀释倍数;W1:样本质量,0.3g;W2:样本细胞壁物质(CWM)质量,g;W3,提取纤维素时称取的细胞壁物质(CWM)质量,g。
1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、 浓硫酸具有强腐蚀性,操作时各个步骤均需特别注意:纤维素提取在加入浓硫酸时,建议枪头伸入样本液面以下,缓慢加入,以防止液体飞溅烧伤;95℃水浴结束取出后需冷却至室温再打开EP管盖,以防液体飞溅烧伤。
3、 由于试剂二挥发性强且具有刺激性气味,建议在通风橱中进行工作液的配制。
1. 取0.3g康乃馨叶片样本提取细胞壁物质(CWM)0.02g,称取烘干的CWM约 5mg(记为W3),提取纤维素,取上清液,用蒸馏水稀释20倍后进行检测,测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.821-0.051=0.77,标准曲线y=13.994+0.0072,计算x=0.0545,按样本质量计算得:
纤维素(mg/g 质量)=22.52×x×W2÷W3÷W1=16.3645 mg/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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