离子结合型果胶(ISP)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/6e1d1a84-4962-493a-a89b-0f129eea84b6.jpg)
溶液的配制:
1、 提取液一:80%乙醇,自备。即将 80 mL 无水乙醇和 20 mL 蒸馏水混合。提供一个 125mL 空瓶。
2、 试剂一:浓硫酸 30 mL,自备。
3、 标准品:10 mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943 mL 提取液三,配成 50 μmol/mL 的标准液。
产品说明:
果胶(Pectin)是构成细胞初生壁和中胶层的主要成分,对细胞起着软化和黏合作用。果胶间以Ca2+桥及其他离子键、氢键、糖苷键、酯键和苯环偶联的方式交联,通过不同的抽提方法可以提取各种形式的果胶,如水溶性果胶(WSP)、离子结合型果胶(ISP)和共价结合果胶(CSP)。
利用带有螯合剂的酸性提取液提取离子结合型果胶(ISP),其在酸性条件下水解生成半乳糖醛酸,后者在硫酸溶液中与咔唑进行缩合反应形成紫红色的化合物,生成物质在530nm处有最 大吸收峰。
技术指标:
最 低检出限:0.0946 μmol/mL
线性范围:0.1-2 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、丙酮、浓硫酸、无水乙醇和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,室温快速匀浆,95℃水浴 20min,冷却至室温,4000g 25℃离心 10min,弃上清。沉淀加入 1.5mL 提取液一和丙酮交替各洗 2 遍(涡旋振荡 2min 左右,4000g 25℃离心 10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁,加入 1mL 提取液二(去除淀粉)浸泡 15 小时,4000g 25℃离心 10min,弃上清,加入 1mL提取液三,充分匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清液待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至530nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 将50μmol/mL 标准液用提取液三稀释为2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL的标准溶液备用。
3、 操作表:
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/c5040a39-c81b-45da-a190-bb0e5d82d5e1.jpg)
三、离子结合型果胶含量的计算
1、标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、离子结合型果胶含量的计算:
离子结合型果胶含量(μmol/g 质量)=x×V提取液三÷W =x÷W
V提取液三:加入提取液三的体积,1mL;W:样本质量,g。
注意事项:
1、浓硫酸具有强腐蚀性,操作时需特别注意,90℃加热取出后冷却再打开盖子,以防液体飞溅烧伤。建议每次实验冷却时间保持一致。
2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 迎春叶片加入 1mL 提取液一,进行样本处理,取上清液按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=0.13-0.079=0.051,带入标准曲线 y=0.3693x-0.0189 得出 x=0.189,带入公式计算
离子结合型果胶含量(μmol/g 质量) =x÷W=1.89 μmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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