单宁酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/c518ebd4-8b1c-41b1-8427-ffb466786398.jpg)
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前取 1 支加入 1 mL 无水乙醇混匀溶解,用不完的试剂可以 2-8℃保存一周;(1 支粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 支粉剂)
2、 标准品:5 mg 没食子酸丙酯。临用前加入 1.178 mL 无水乙醇充分混匀溶解,配成 20 μmol/mL 的标准溶液,2-8℃保存两周。
产品说明:
单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20),存在于富含单宁的植物,也广泛存在于微生物中,可以水解酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯(PG)作为单宁酶酶促反应的底物,其在270nn下有特征吸收峰,根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/b7ed1974-8526-4bc4-94f4-3fb9b105faa2.jpg)
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。10000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至270nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:取5μL 20μmol/mL的标准溶液,加入1995μL提取液,充分混匀,配制成0.05μmol/mL标准液使用,现用现配。(实验中每管需要200μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3、 对照管样本处理:吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管,沸水浴5min,冷却至常温待测。
4、 加样表(在1.5mLEP管中分别加入)
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/9fd76178-7a3c-40a8-b80f-745149ac7860.jpg)
三、单宁酶活力计算
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/36bbce66-02f0-4ae3-b690-936f0225413d.jpg)
注意事项:
如果A测定大于1.5,可以适当加大稀释倍数,保证总体积0.2mL不变,如5μL上清液和195μL提取液(相当于F=200/5=40),计算公式中需改变F和V上清液的数值。
实验实例:
1. 取 0.1g 玉兰叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A 对照管-A 测定管=0.6631-0.6258=0.0373,按样本质量计算酶活得:
单宁酶(U/g 质量)=1000×ΔA÷A 标准÷W×F(稀释倍数)=1119 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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