维生素 C 含量检测试剂盒说明书
高效液相色谱法
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:50T/48S
产品简介:
维生素 C 又被称为抗坏血酸,是一种水溶性维生素,主要存在于新鲜的蔬菜及水果中。维生素
C 有强还原性,易被氧化。具有利于组织创伤口愈合,促进胶原蛋白合成等生理功能。
维生素 C 在 210 nm 处存在紫外吸收,可利用紫外检测器测定其含量。
试验中所需的仪器和试剂:
高效液相色谱仪(Polaris C18-A 色谱柱(4.6×250 mm),紫外检测器(VWD))、台式离心
机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管(1.5 mL)、针头式过滤器(水系)、注射器、抽滤器、滤膜(水系、有机系)、棕色进样瓶、超纯水、甲醇(色谱纯)。
产品内容:
提取液:液体 50 mL ×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 1.5 mL ×1 瓶, 4℃保存。
试剂二:粉剂×2 瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 1 mL 蒸馏水配制成 5 mg/mL 维生素 C 标准溶
液,4℃密封可保存两周,避免阳光直射。
实验前准备工作:
1. 将 1 瓶试剂二溶解到 1000 mL 超纯水中,再加入 0.55 mL 的试剂一,混匀,得到流动相 A。
2. 将 1000 mL 配制好的流动相 A、甲醇(色谱纯)用滤膜抽滤。(配制好的流动相 A 采用 0.22 μm水系滤膜抽滤,甲醇采用 0.45 μm 有机系滤膜抽滤)。
3. 将抽滤好的流动相超声 20 min,除去气泡。
4. 标准品的配制:将 5 mg/mL 的维生素 C 标准溶液用蒸馏水稀释成 2000 μg/mL、500 μg/mL、100
μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL、0.8 μg/mL 的维生素 C 标准溶液。(标准品浓度仅供参考,可根据实际样品浓度进行调整)。4℃避光保存(密封),测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶
内,待测。
操作步骤:
一、维生素 C 的提取:
按样本质量(g): 提取液体积(mL)1:5~10 比例进行提取,建议称取约 0.2 g 新鲜样本,加入
1 mL 提取液,冰浴匀浆,10000 rpm 4℃离心 10 min,取上清液(若仍有浑浊,可再次离心),测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测(若上清液颜色过深或者浓度过高,可用蒸馏水稀释后再次过滤待测)。
二、测定步骤:
1. 开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮,安装上色谱柱,打开软件,在方法组中设置进样量为 10 μL,柱温 30℃,流速为 0.4 mL/min,紫外检测器:波长为 210 nm。单个样本走样时间 15 min,设置完毕保存方法组。
3. 采用相应的流动相清洗柱子,用流动相 A 平衡柱子,待基线稳定后开始加样。
4. 检测待测的标准品溶液,进样量为 10 μL,在 15 min 内可分离出维生素 C,维生素 C 的保留时间约为 11.3 min(体系、柱子、流动相 pH、温度等不同,保留时间有差异,仅作为参考)。
5. 检测待测的样品溶液,进样量为 10 μL,在相应的保留时间处检测维生素 C 的峰面积。
6. 序列完整加样表:(包含单个样本测定完成后色谱柱的清洗和再平衡过程)
![QQ截图20220615142154.jpg QQ截图20220615142154.jpg](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/6428758f-222a-411c-9fe6-631154b2af0c.jpg)
三、维生素 C 含量计算
以标准品浓度(μg/mL)为横坐标 x,峰面积为纵坐标 y 绘制维生素 C 的标准曲线 y=kx+b,将
样本的峰面积代入标准曲线,计算提取液中维生素 C 的浓度 x(μg/mL)。
维生素 C 的含量(μg/g)= x ×V 提取÷W×F= x×F÷W
V 提取:加入提取液总体积,1 mL;W:样本质量,g;F:稀释倍数,稀释后测试的样本,计
算时需要乘以相应的稀释倍数。
注意事项
1. 测试完毕后,需要用高浓度的超纯水相冲洗色谱柱(约 20-30 个柱体积),以防阻塞色谱柱,再用高浓度的有机相冲洗色谱柱,最 后按柱子的种类规范冲洗,防止损伤色谱柱。
2. 标准品的稀释倍数要根据样品中维生素 C 的浓度确定,样品中维生素 C 的峰面积必须在不同浓度的标准品溶液的峰面积之内,该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中维生素 C 浓度过高,建议稀释后再测。
3. 若样本量过大,建议每天测试一次标准溶液(一个标准溶液即可),以确定相应的保留时间,待测溶液测试前须放置至室温状态。
4. 为了排除梯度洗脱基线漂移的影响,可进行一次空白检测。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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