原果胶含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060902134502150](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902134502150.png)
溶液的配制:
1、 提取液一:80%乙醇,自备。即将 80 mL 无水乙醇和 20 mL 蒸馏水混合。
2、 试剂一:浓硫酸 30 mL,自备。
3、 标准品:10 mg 半乳糖醛酸,临用前加入 0.943 mL 提取液三,配成 50μmol/mL 的标准液。
产品说明:
果胶是植物细胞壁主要组成成分之一,分为水溶性果胶和不溶性果胶,不溶性果胶为原果胶。原果胶是不溶于水的物质,但可在酸、碱、盐等化学试剂及酶的作用下,加水分解转变成水溶性果胶,在食品、纺织、印染、烟草、冶金等领域具有较广泛的应用。
原果胶在碱性条件下水解为可溶性果胶,并进一步转化为半乳糖醛酸,产物在强酸中与咔唑缩合生成紫红色化合物,在530nm处有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、丙酮、浓硫酸、无水乙醇和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,室温快速匀浆,95℃水浴 20min,冷却至室温,4000g 25℃离心 10min,弃上清。沉淀加入 1.5mL 提取液一和丙酮交替各洗 2 遍(涡旋振荡 2min 左右,4000g 25℃离心 10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁,加入 1mL 提取液二(去除淀粉)浸泡 15 小时,4000g 25℃离心 10min,弃上清,加入 1mL提取液三,充分匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清液待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至530nm,蒸馏水调零。
2、 将50μmol/mL标准液用提取液三稀释为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL的标准溶液备用。
3、 操作表:
![image 2022060902143303125](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902143303125.png)
三、原果胶含量的计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、 原果胶含量的计算:
原果胶含量(μmol/g 质量)= x×V提取液三÷W=x÷W
V提取液三:加入提取液三的体积,1mL;W:样本质量,g。
注意事项:
1、 浓硫酸具有强腐蚀性,操作时需特别注意,90℃加热取出后冷却再打开盖子,以防液体飞溅烧伤。
2、 若 ΔA 超过 0.3,可将样本用提取液三进行适当稀释再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
实验实例:
1. 取 0.1g 木槿加入 1mL 提取液一,室温快速匀浆,95℃水浴 20min,冷却至室温,4000g 25℃离心 10min,弃上清。沉淀加入 1.5mL 提取液一和丙酮交替各洗 2 遍(涡旋振荡 2min 左右,4000g 25℃离心 10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁,加入 1mL 提取液二浸泡 15 小时,4000g 25℃离心 10min,弃上清,加入 1mL 提取液三,充分匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清液之后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.21-0.12=0.09,依据标准曲线 y=0.4121x-0.0183 计算 X=0.2628μmol/mL,按样本质量计算含量得:原果胶含量(μmol/g 质量)=x÷W=2.628 μmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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