总巯基含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060902014735263](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902014735263.png)
溶液的配制:
标准品:10 mg 还原型谷胱甘肽(GSH)。临用前加入 1.3 mL 蒸馏水,配制成 25 μmol/mL,2-8℃保存两周。
产品说明:
生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质,而且参与活性氧清除,后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量,能够间接测定蛋白质巯基含量。巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在412nm处有最 大吸收峰。
![image 2022060902020821253](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902020821253.png)
技术指标:
最 低检出限:0.0088 μmol/mL
线性范围:0.015625-1 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、台式离心机、恒温水浴锅、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 动物、植物组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(称取称取约 0.1g 组织,加入 1mL的提取液),冰浴匀浆,8000g,常温离心 10min,取上清待测。
2. 血清,培养液:直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。
二、 测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、标准液的稀释:将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL的标准液,现用现配。
3、 标准液稀释可参考下表:
![image 2022060902023773857](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902023773857.png)
备注:实验中每个标准管需 40μL 标准溶液。
4、 操作表
![image 2022060902025083674](https://shzbio.net/upload/ueditor/image/20220609/2022060902025083674.png)
三、计算公式
1、标准曲线的绘制:根据标准管的浓度(y,μmol/mL)和吸光度ΔA标准(x,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA测定(x,ΔA测定)带入公式计算样本浓度(y,μmol/mL)。
2、总巯基含量计算:
(1)按样本质量计算:总巯基含量(μmol/g 质量)=y×V样总÷W=x÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:总巯基含量(μmol/mg prot)=y×V样总÷(Cpr×V样总)=y÷Cpr
(3)按血清、培养液体积计算:总巯基含量(μmol/L)=y×V样÷(V样×10-3)=1000y
V样总:加入提取液体积,1mL;V样:加入的样本体积,0.04mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;10-3:单位换算系数,1mL=10-3L。
注意事项:
如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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