丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060701055243014](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060701055243014.png)
溶液的配制:
1. 试剂二:为易挥发试剂,用完后尽快密封,-20℃保存。
2. 工作液的配制:临用前把 5.75mL 试剂四、一支试剂五、0.45mL 试剂六、1.75mL 试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用(共 15.45mL,约 85T);用不完的试剂-20℃分装保存,可保存 4 周。避免反复冻融。
产品说明:
PDH(EC 4.1.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
PDH 催化丙酮酸脱氢,同时还原 2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致 605nm 光吸收的减少。
![image 2022060701063808961](https://www.shlmai.net/upload/ueditor/image/20220607/2022060701063808961.png)
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨,4 ℃11000g 离心 10min,取上清,置冰上待测。
2. 细胞或者细菌样本:先收集 500 万细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;之后加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二,冰浴超声波破碎细菌(功率 200 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 5 min);然后 11000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清(浆)及其它液体样本:直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 605nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 每个样本需要 180μL 工作液,根据实验所需取出一定量的工作液置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴锅中水浴 10min。
3、 空白管:在微量比色皿或 96 孔板中加入 180μL 工作液和 10μL 水,混匀,立即记录 605nm 处 10s 处吸光值 A1和 1min10s 后的吸光值 A2,计算 ΔA 空白=A1-A2。空白管只需测 1-2 次。
4、 测定管:在微量比色皿或 96 孔板中加入 180μL 工作液和 10μL 样本,混匀,立即记录 605nm 处 10s 处吸光值 A3和 1min10s 后的吸光值 A4,计算 ΔA 测定=A3-A4。
三、PDH 活性计算
a.用微量比色皿测定的计算公式如下
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/mg prot)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总×109]÷(Cpr×V 样) ÷T
=904.762×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/g 质量)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T
=913.81×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/104 cell)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T
=1.828×(ΔA 测定-ΔA 空白)
4. 按样本体积计算
单位的定义:每 mL 液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/mL)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T
=904.762×(ΔA 测定-ΔA 空白)
V 反总:反应体系总体积,1.9×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;
V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/mg prot)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T
2.按样本质量计算
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/g 质量)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T
=1827.62×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
3.按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/104 cell)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T
=3.655×(ΔA 测定-ΔA 空白)
4.按样本体积计算
单位的定义:每 mL 液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性(U/mL)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T
=1809.524×(ΔA 测定-ΔA 空白)
V 反总:反应体系总体积,1.9×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L/mol/ cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
注意事项:
1、测定过程中所有样本在冰上放置并于 2 小时内检测,以免变性和失活。
2、测定管的 ΔA 值在 0.01-0.25 之间,若测定管的 ΔA 值大于 0.25,需将样本进行稀释。计算公式中乘以稀释倍数。若测定管的 ΔA 值小于 0.01,需加大样本量后重新测定,注意同步修改计算公式。
3、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨,4℃、11000g 离心 10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923,ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011,按样本质量计算酶活得:
PDH 活性(U/g 质量)= 913.81×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W=1747 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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