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迈安纳 INano平台成功助力用户开发新型四价正痘病毒疫苗

迈安纳

2023/05/16 08:40

阅读：27

四价mRNA疫苗激发针对牛痘和猴痘病毒抗原的有效免疫应答

2022年人类猴痘病毒感染的全球暴发引起了公众对人畜共患疾病人际传播威胁的卫生关注。

鉴于有证据表明，包括牛痘和骆驼痘在内的其他正痘病毒也报告对人类具有传染性，并且存在天花从实验室意外逃逸的风险，此迫切需要开发一种具有广泛预防正痘病毒的痘病毒疫苗，以储备以应对未来的紧急情况。

在这项研究中，我们构建了一种新的痘病毒候选疫苗mRNA-ALAB-LNP，编码牛痘病毒抗原A27、L1、A33和B5。单次免疫后，小鼠即产生强效的抗L1特异性抗体，和中等程度的抗A33-、抗A27 -和抗B5特异性抗体反应。第二次接种后，四种抗原的抗体反应均显著增强，IgG滴度均>5 logs，其中抗A33的 IgG滴度最高。

实验结果

mRNA分子的设计与合成

设计了一个常规的mRNA序列，包含帽结构、5'UTR非翻译区、CDS翻译区、3'UTR非翻译区和PolyA 结构。CDS翻译区表达4个串联的VACV抗原分子(A27, L1, A33, B5)被连接体分离，mRNA分子命名为mRNA- ALAB。在完整的mRNA序列的5'端添加一个T7启动子和在3'端添加一个BspQI限制性内切酶切割位点（图1A）。用BspQI酶切质粒可以有效地线性化质粒模板(图1B)。以线性化质粒为模板，通过体外转录反应合成了mRNA-ALAB分子。琼脂糖凝胶电泳和HPLC-SEC分析表明，合成mRNA具有良好的完整性(图1C)和纯度(图1D)。

图1: mRNA-ALAB的结构设计和制备

mRNA-ALAB-LNP的制备和表征

本研究中，使用迈安纳微流控设备INano L进行脂质和RNA的充分混合，空载LNP和包载了RNA的LNP的粒径分别为75nm和84nm（图2B），PDI<0.1显示了良好的均一性，包封率约为98%。转染293T细胞，抗A27, L1, A33, B5的阳性率分别为20%, 85%, 6% 和75%（图3）。

图2: mRNA-ALAB-LNP的准备和表征

图3: 转染mRNA-ALAB-LNP后四种靶蛋白的表达

mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠中诱导了强效的抗原特异性结合抗体反应

为了研究mRNA疫苗的免疫原性，6-8周龄BALB/c小鼠以2周间隔肌肉注射2次疫苗(图4A) ，每次注射剂量为20ug。于首次注射前3天、第14天(首次注射后2周)、第28天(首次注射后4周)和第42天(增强注射后2周)，采血取样，检测抗原特异性结合抗体(图4B-4E)。第二次免疫后45 d取脾进行细胞免疫评价。在第一次免疫后，诱导了强效的抗L1特异性和中等的抗A33 -、抗A27 -和抗B5特异性抗体反应，并且针对所有四种抗原的抗体反应随着时间的推移而增加。同时，加强免疫后4种抗原的抗体水平显著升高。这些结果表明，mRNA -ALAB- LNP疫苗能够诱导强效的抗原特异性结合抗体反应。

图4：mRNA-ALAB-LNP在小鼠体内引起强效抗体反应

mRNA-ALAB-LNP疫苗免疫血清展现了强效的痘病毒中和活性

为了确定mRNA -ALAB- LNP疫苗产生的抗体是否具有病毒中和活性，我们用100 CCID50 VACV病毒和增强疫苗注射后2周的灭活血清孵育，以检测中和活性。通过观察和分级细胞病变效应(CPE)来计算血清中和活性。病毒对照(VC)和空载LNP免疫血清，在1:80的稀释下，未表现出中和活性，感染的BSC-1细胞显示出明显的CPE(图5A)。相反，mRNA -ALAB- LNP接种小鼠的免疫血清，在1：80和1：640和1：1280的稀释下，在感染的BSC-1细胞中未见CPE，显示出细胞免受病毒感染的保护(图5A)。在本实验中，mRNA -ALAB- LNP的平均中和抗体滴度可达1431 (图5B)。

图5：mRNA-ALAB-LNP诱导出抗牛痘病毒的强效中和抗体

mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠体内诱导抗原特异性细胞免疫反应

为了探讨mRNA疫苗是否能诱导小鼠特异性细胞免疫应答，在增强针注射45 d后收集小鼠脾细胞，分别用ELISPOT法检测针对6种抗原肽文库A27、L1-1、L1-2、A33、B5-1、B5-2的特异性IFN-γ阳性T细胞。对所有四种抗原均检测到特异性IFN-γ应答，且应答显著高于空白LNP免疫对照组(图6A)。A27肽库和A33肽库对IFN-γ的刺激水平较高，分别为904个点/百万细胞和27747个点/百万细胞。与抗A33的总特异性IgG应答最高一致(图3D)，对A33肽库的应答中IFN-γ应答也最高(图6B)。

图6：mRNA-ALAB-LNP诱导小鼠细胞免疫应答(n=4)

mRNA-ALAB-LNP接种小鼠血清显示针对猴痘病毒同源抗原的高水平交叉结合效应

将mRNA-ALAB-LNP免疫小鼠的免疫血清依次稀释，与4种蛋白A29、M1、220 A35和B6孵育，检测交叉结合抗体滴度。ELISA结果显示，首次免疫后对猴痘抗原A35、M1、222、A29和B6均有较强的血清IgG应答，且随着免疫时间的延长，抗体滴度逐渐升高。(图7A- 223 7D)。抗A29抗体平均滴度从2040 (初次免疫后2周)增加到4440 (初次免疫后4周)，抗M1抗体从74520 (初次免疫后2周)增加到184680 (初次免疫后4周)，抗A35抗体从2520 (初次免疫后2周)增加到9000 (初次免疫后4周)，抗B6特异性抗体从5880 (初次免疫后2周)增加到10920 (初次免疫后4周)。此外，增强免疫2周后，4种抗体水平均显著升高，其中抗A29、抗M1、抗A35和抗B6抗体滴度分别达到110000、2430000、558000和1782000。总之，这些结果表明，编码牛痘抗原(A27、L1、232、A33和B5)的mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠体内诱导了针对各自猴痘抗原(A29、M1、A35和B6)的等效或更好的交叉反应抗体。(图7 A-7D)。

图7：mRNA-ALAB-LNP可诱导针对MPXV抗原的强效交叉反应抗体。

总结

综上所述，本研究基于牛痘病毒抗原A27, L1, A33、B5，开发了一种新的四价mRNA-ALAB-LNP疫苗，具有潜在的抗正痘病毒的潜力。该候选疫苗对牛痘病毒和猴痘产生了显著的抗体应答。这些数据证明了mRNA-ALAB- 282 LNP疫苗设计的可行性，并提供了其作为广泛的正痘病毒候选疫苗的潜力的初步证据。

文献来源：

Su et al., A Quadrivalent mRNA immunization elicits potent immune responses against vaccinia and monkeypox viral antigens – a step closer to a broad orthopoxvirus vaccine. bioRxiv. Doi: 10.1101/2023.04.23.537951.

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