脂质纳米粒-自复制RNA疫苗储存条件优化

脂质纳米粒-自复制RNA疫苗储存条件优化

1、 简介

RNA分子递送实验可以追溯到1978年，当时用脂质体将编码兔球蛋白的mRNA体外转染给小鼠淋巴细胞。从那时起，可离子化的脂质和RNA递送技术的进步导致美国食品和药物管理局（FDA）在2018年批准了第一个基于siRNA的脂质纳米粒子（LNP）疗法，Onpattro (Patisiran)。到2020年初COVID-19大流行发生时，几个包裹mRNA的LNP配方已经进入临床试验阶段。2020年12月，FDA为辉瑞-生物技术公司（BNT162b2）和Moderna公司（mRNA- 1273）的COVID-19疫苗颁发了紧急使用授权（EUA），这两种疫苗都利用加载编码病毒尖峰蛋白的mRNA的LNPs作为免疫原。目前，各种RNA产品的LNP配方，包括寡核苷酸（如siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等）、碱基修饰的RNA、序列优化的RNA以及来自阿尔法病毒、黄病毒、麻疹病毒和横纹肌溶解病毒的自复制RNA，正处于临床开发的不同阶段，应用范围从疫苗到癌症治疗。

虽然两种获批的COVID-19的mRNA疫苗结构相似，但BNT162b2使用磷酸盐缓冲液（PBS）作为溶剂（含20% w/v蔗糖），而mRNA-1273使用tris-HCl缓冲液（TBS；含8% w/v蔗糖）。据报道，这两种配方在这些蔗糖缓冲液中都能有效的地保持疫苗的稳定性和有效性，但储存温度和寿命的范围很广；mRNA-1273在-20℃下可储存6个月，而BNT162b2在-70℃下浓缩可以储存6个月，最近的数据表明在-25℃至-15℃下储存两周也很稳定。关于关键储存参数（如冷冻保护剂、分散剂、温度等）对LNP-RNA疫苗的影响，公众的认识是有限的。在数量有限的已发表的研究中，发现有几个常见的参数会影响储存结果。糖基冷冻保护剂，如蔗糖、海藻糖和甘露醇，可以提高LNPs在冻融和冻干期间的稳定性。在不同的水溶剂（如水、盐水）或与有机溶剂（如乙醇）混合构成的LNP在提高LNP-RNA的稳定性方面显示出轻微的效果。然而，最主要的变量似乎是储存温度，从液氮中的速冻到4℃的冷藏，其中不同的配方适宜的储存温度也不尽相同。我们以前报道过一种由TT3（一种类似脂质的可电离分子）、DOPE、胆固醇和DMG- PEG2k组成的制剂，该制剂加载了编码荧光素酶的mRNA，成功地在液氮中闪冻，并在5% w/v蔗糖或海藻糖中储存长达3个月。另一方面，由不明的可离子化脂质、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2k组成的制剂，加载了编码SARS-CoV-2小鼠适应株的受体结合域（RBD）的mRNA，在室温下至少保持了7天，在4℃可能会更久。另一项研究发现了咪唑修饰的脂质，似乎通过添加醚键和允许π-π堆叠的胺基头部形成高度稳定的RNA负载结构；这种LNP能够在4℃下保持RNA的完整性和功能达25周，在25℃下保持18周，在37℃的PBS中保持3周而不需要冷冻保护剂。

LNP- RNA疫苗的保质期范围很广，其确切原因仍然未知。此外，许多关于LNP- RNA稳定性的研究都集中在使用报告基因（如荧光素酶、GFP）编码的mRNA的功能测量上，而不是直接评估疫苗的免疫原性，并且缺乏将LNPs的结构完整性与疫苗活性联系起来的分析。我们研究了冷冻保护剂、缓冲液类型（磷酸盐和三缓冲盐水）和储存温度对自复制RNA负载的LNP（LNP-RNA）疫苗的结构和功能维持的影响。

2. 结果

蔗糖对维持LNP-RNA的结构和功能完整性的影响

脂质纳米颗粒（LNPs）是利用微流控系统将乙醇中的脂质有机相与水中的水相repRNA混合，诱导包裹自复制RNA的LNPs自组装（LNP-RNA）。LNPs的制备采用了可电离的脂质胺基与RNA磷酸盐2:1的比例（相当于可电离的脂质：RNA质量比为2.9:1）。将得到的颗粒透析到pH7.4的PBS或含有0%、5%、10%或30% w/v蔗糖的TBS中，以测试缓冲剂和冷冻保护剂的影响。然后将颗粒储存在4℃、-20℃、-80℃或-200℃（在液氮中闪冻）。7天后，在25℃解冻LNP- RNA，并使用动态光散射（DLS）测量其流体力学尺寸和多分散性。与各自的缓冲液和蔗糖浓度中新制备的LNPs作为对照。如表1所示，无论缓冲液和蔗糖浓度如何，在-80℃储存LNPs会导致颗粒聚集和高的多分散性指数，而在其他温度（4℃、-20℃和-200℃）下储存则保持LNPs的尺寸分布与新制备颗粒相当。值得注意的是，在PBS和TBS储存的LNPs的缓冲液中没有糖，导致粒度分布增加了20-50纳米，表明了蔗糖的低温保存效果。

当LNPs从-80℃的储存中解冻时，LNPs的平均PDI明显增加到0.9左右，而新制备样品的PDI为0.3左右。新制备的LNP-RNA，在-20℃、-80℃和-200℃储存后，其平均包封效率保持在90%左右，而在4℃储存的颗粒显示出明显下降到70%以下（P < 0.001），颗粒外可检测到的RNA有所增加（P < 0.001）。总的来说，在确定LNPs的结构保留方面，温度似乎比0-30% w/v范围内的蔗糖浓度起着更主导的作用。

表1 脂质纳米颗粒的动态光散射（DLS）评估。(n = 3).

由于储存在0% w/v的蔗糖中似乎可以保持颗粒的整体物理完整性，尽管流体力学尺寸略有变化，需要确定糖的存在对于保持体内的疫苗效力是否有影响。为此，我们在LNPs上装载了编码稳定的HIV Env SOSIP三聚体免疫原（称为N332-GT2）的repRNA，该免疫原是为靶向启动HIV env尖峰的N332超级位点的B细胞。疫苗颗粒在含有0%、5%或10% w/v蔗糖的PBS中在-20℃储存一周，然后解冻并在小鼠体内注射，4周后通过ELISA评估血清抗体滴度（图1）。随着蔗糖浓度的增加，抗体产生有增加的趋势。虽然储存在0% w/v蔗糖的PBS中的LNPs（图1a）能够诱发针对免疫原的抗体产生，但其水平明显低于新制备的疫苗（p = 0.0118）和储存在10% w/v蔗糖中的疫苗（p = 0.0185，图1d）。储存在5% w/v蔗糖中引起的抗体滴度与新疫苗没有统计学上的明显差异（p = 0.1069），但在一些动物中呈现出反应较弱的趋势（图1b）。然而，用储存在10% w/v蔗糖中的LNP-RNA接种的动物产生的血清抗体稀释曲线与用新制备的LNP-RNA接种的小鼠很好地重叠，没有统计学上的显著差异（p = 0.9959，图1c，d）。

图1. 缓冲液和蔗糖浓度对脂质纳米颗粒疫苗储存的影响。

由于我们观察到在PBS和TBS中的PDI测量值最低，而且在10% w/v蔗糖中储存的抗体反应最可靠，我们决定在后续研究中使用这一浓度的蔗糖。

缓冲液对LNP-RNA体内性能的影响

我们对储存在不同条件下的LNPs进行了体内RNA表达的观察。制备了携带编码萤火虫荧光素酶的repRNA的LNPs，LNP-RNA在10% w/v蔗糖的PBS或TBS中透析。然后将LNPs在4℃、-20℃、-80℃或-200℃（液氮）储存7天，再解冻用于注射。在注射当天，制备新样品并在10% w/v蔗糖的PBS或TBS中进行透析。将LNPs注射到小鼠的左右腓肠肌中，然后用IVIS Spectrum全动物成像系统对荧光素酶的表达进行纵向生物发光成像（图2a-c）。正如我们之前对该系统的研究所预期的那样，荧光素酶的表达在大约7-10天内迅速攀升，然后在大约30天后慢慢向基线衰减。与图中所示的颗粒分布数据一致，储存在-80℃的PBS或TBS中的LNPs表现出10至100倍的荧光素酶峰值信号，表明RNA的传递明显减弱（ppeak = 0.0003）。在其他温度下储存在PBS和TBS中的LNPs，尽管表现出与新制备样品相似的颗粒分布，但与新制备的颗粒相比，在注射后第7天的峰值时间点，通常产生约2至4倍的低信号。此外，储存在-200℃的样品在第15天和第20天之间显示出早期表达的衰减。与新制备样品表现最接近的是在10% w/v蔗糖的PBS中制备的LNP，并储存在-20℃（ppeak = 0.8777），表明这种条件可能最佳保留LNP的结构和功能。

我们接下来评估了LNP-复制子疫苗的免疫原性，这些疫苗加载了编码N332-GT2 HIV免疫原的repRNA，并在10%蔗糖的PBS或TBS中储存7天，温度为4℃、-20℃、-80℃或-200℃（液氮）。用回收的LNPs对小鼠进行注射，4周后通过ELISA评估血清抗体反应（图2d-m）。与其他储存条件或新制备LNPs相比，储存在4℃或-80℃的疫苗显示出抗体反应的急剧下降（图2d）。相比之下，PBS和TBS制备的疫苗在-20℃（图2e和j）和-200℃（图 2g和l）诱发的抗体滴度与新制备的疫苗没有统计学差异。虽然结果非常相似，但根据发光报告和抗体反应的统计，我们将重点缩小到分析在PBS中制备的LNPs，而不是TBS（图2h和m）。

图2. 在不同条件下储存的包裹RNA的LNPs给药后的体内转染和抗体滴度反应。

对LNP稳定性的定性评估

虽然动态光散射（DLS）提供了关于颗粒大小分布和流体力学尺寸的定量信息，但在多分散的样品中，信息往往偏向于较大的颗粒或聚集物。为了进一步了解颗粒结构，我们接下来对从不同储存温度下回收的样品进行了透射电子显微镜（TEM）和低温电子显微镜（cryo-EM）成像。TEM和低温电镜图像都显示，在新制备的样品和那些在4℃或-20℃储存一周的样品中，LNPs的直径约为45nm，分散相对单一（图3a-c和f-h）。然而，在-80℃或-200℃储存后解冻的样品（在液氮中闪冻）显示LNPs明显聚集或融合成大的结构（图3d，e和i，j）。

图3. 储存7天的LNPs的低温电子显微镜（Cryo-EM；顶行）和透射电子显微镜（TEM；底行）图像。

不同温度下储存的LNP-复制子疫苗的免疫原性

为了进一步了解储存对LNP-RNA疫苗效力的影响，我们评估了用新制备的颗粒与储存在不同温度下的LNPs进行免疫后的免疫反应的其他数据。LNPs搭载了编码N332-GT2 HIV免疫原的repRNA，在10% w/v蔗糖的PBS中储存在4℃、-20℃、-80℃、-200℃中7天，然后解冻并与新制备的样品一起给小鼠注射。在注射后第2周，取小鼠腘窝淋巴结（腓肠肌注射部位的引流结）以评估生发中心（GC）反应（图4a-e），收集脾细胞以使用ELISpot评估T细胞反应（图4f）。对从引流的腘窝淋巴结中回收的细胞进行流式细胞分析发现，虽然储存在4℃、-20℃和-200℃的疫苗诱发了突出的GC B细胞反应，但储存在-80℃的疫苗并没有引起与对照动物有统计学差异的反应（P = 0.9619，图4a和c）。尽管诱导了GC B细胞的分化，但储存在4℃或-200℃的疫苗未能培养出有意义的抗原特异性GC B细胞群，这些细胞能与重组HIV Env三聚体探针结合，只有储存在-20℃的疫苗能引起强烈的抗原特异性GC B细胞反应，与新制备的疫苗所引起的反应一致（图4b和d）。滤泡辅助性T细胞（Tfh）反应不明显，在任何一组中都没有统计学差异（图4e）。与GC数据相反，所有的疫苗都能诱导脾脏中产生IFN-γ的抗原特异性T细胞反应，组间差异不大（图4f）。基于这些结果，我们选择-20℃冷冻作为我们LNP-RNA疫苗配方的最佳储存条件。

图4. 储存温度对疫苗免疫原性的评价。

我们发现在使用新制备、储存在-20℃和储存在-200℃的疫苗免疫后，肌肉中的IFN-γ、KC、MCP-1、RANTES、IP-10、IL-10、IFN-β、IFN-α和IL-6水平有类似的增加。相比之下，储存在4℃或-80℃的疫苗显示出更多的沉默反应。

在-20◦C下冷冻的LNPs和在4℃下解冻的LNPs的保质期

我们接下来评估了LNPs在更长时间内储存的稳定性。LNPs装载了编码萤火虫荧光素酶的repRNA，并在-20℃的10% w/v蔗糖的PBS中储存了7天或30天。然后，我们将解冻的颗粒或新制备的给小鼠分组进行静脉注射，并通过IVIS成像评估30天内肌肉的生物发光信号。如图5a，新制备的疫苗和储存的疫苗之间没有统计学意义（P>0.2）。接下来，我们制备了装载有编码N332-GT2免疫原的复制子的LNPs，并在解冻前将其储存7、14或30天，以便在小鼠体内肌肉注射。然后在接种疫苗后六周对小鼠进行放血，用ELISA法对血清中的抗体滴度进行量化。储存到30天的疫苗对HIV免疫原产生的抗体反应与新制备的疫苗相当（图5b-e）。

图5. 在冷冻或解冻状态下长期储存的LNP-RNA疫苗的保质期。

我们验证了在10% w/v蔗糖的PBS中的LNP-RNA疫苗可以在-20℃储存至少30天而不失去效力后，我们就研究了LNPs在解冻后的冷藏（4℃）下储存的保质期。这种实验设计模拟了临床环境，即冷冻疫苗解冻后供病人服用，剩余的剂量储存在4℃，以便在其他时间服用。为此，在10% w/v蔗糖的PBS中制备了装载有编码N332-GT2免疫原的LNPs，在-20℃储存7天，然后在室温下短暂解冻，再放入4℃的冰箱中储存7、14或30天。在4℃解冻的LNPs和新制备的LNP疫苗被肌肉注射到小鼠身上。疫苗接种后4周收集小鼠血清，用ELISA法定量检测抗体滴度。如图5f-j所示，疫苗诱导的抗体滴度与从-20℃解冻后在4℃的储存时间增加之间存在明显的负相关。在解冻后4℃储存一天就会产生很强的抗体滴度，虽然已经有下降的趋势，但在统计学上与新鲜样品没有区别（图5f；p1d = 0.4615）。解冻后保存7天的LNPs未能使5只动物中的2只血清转化（图5g；p7d = 0.0014），这种抗体反应的衰减在4℃保存14或30天后仍在进一步持续（图5h-i）。

LNP-RNA疫苗的冻干处理

冷冻干燥已被证明对LNP- RNA制剂具有挑战性。为了确定影响冻干LNP-RNA颗粒稳定性的主要因素，我们选择了三个因素来测试冻干：冷冻温度、冷冻保护剂浓度和样品浓度。为此，对制剂进行了冷冻、冻干和再水化，以进行颗粒分布和流体力学直径的DLS评估。我们测试了在-20℃的初始冷冻以及-80℃和使用液氮在-200℃的瞬间冷冻，这些都是冻干时更常用的冷冻温度。在-20℃冷冻后被冻干并重新悬浮的颗粒能够保持0.272的多分散指数（PDI），而-80℃和-200℃组的颗粒显示出聚集，PDI达到0.710（-80℃）和0.517（-200℃）（图6a）。颗粒的大小也从平均流体力学直径（通过强度分布）421纳米（-20℃）增加到877纳米（-80℃）和1219纳米（-200℃）。我们观察到随着温度的升高，颗粒有变小的趋势。在-20℃储存的疫苗显示平均流体力学直径为421纳米，但在统计学上与新制备样品没有区别（P = 0.1858）。我们接下来测试了冷冻保护剂浓度对LNP-RNA冻干的影响（图6b）。在PBS、10% w/v蔗糖或30% w/v蔗糖中制备疫苗颗粒，并在进行冻干之前在-20℃冷冻。然后将干燥的颗粒在去离子水中重新水化，进行DLS评估。在这里，我们发现在PBS中冻干的样品与用蔗糖冷冻保护的样品之间有明显的区别。与新制备的平均PDI为0.233的LNPs相比，PBS样品的平均PDI为0.638，10% w/v蔗糖样品为0.165，30% w/v蔗糖样品为0.235，这表明在蔗糖存在的情况下，粒子的单分散程度更高。与新制备样品相比，PBS中颗粒的平均流体力学尺寸明显增加，平均为613纳米，而新制备样品平均为96纳米（p < 0.0001）。在10% w/v蔗糖中的冻干导致平均粒径轻微增加到144纳米，但这种差异没有统计学意义（p = 0.7957）。最后，30% w/v蔗糖样品的平均粒径为94.0 nm，从统计学上看，这与新制备样品最接近（p > 0.9999）。我们评估了LNP-RNA浓度对冻干的影响。在这里，我们将相同质量的LNP-RNA冷冻并冻干，在-20℃的PBS中增加10% w/v蔗糖的体积，并将冻干的颗粒重悬浮在同等体积中进行DLS评估。选择10% w/v的蔗糖浓度而不是30% w/v的蔗糖浓度是为了适应重悬浮适合体内给药的最终蔗糖浓度；事实上，在低重悬浮中存在过量的蔗糖导致水合疫苗的粘稠度不适合下游分析和体内给药。图6c显示，虽然配方中没有统计学上的明显差异，但随着LNP浓度的降低，PDI和流体力学尺寸有下降的趋势。

图6. 冻干的LNP-RNA制剂的评价。

最后，我们将新制备的和冻干的LNPs与编码萤火虫荧光素酶的repRNA装载在一起进行肌肉注射，使用IVIS生物发光成像系统评估体内转染效率（图6d-e）。在这项研究中，我们选择了被发现能最好地保持粒子结构的LNPs置于10% w/v的蔗糖中，在进行冻干前以3.3 ng/μL的浓度冷冻在-20℃。在给药后的第1天，新制备的和冻干的LNP-复制子都显示出强烈的荧光素酶表达，但冻干颗粒的信号是新制备样品的50%左右（p = 0.0191）。综上所述，我们调查了有助于维持冻干颗粒的大小和分布的三个参数。通过优化和结合这些因素，我们能够改善冻干和重悬后LNP-RNA结构和分散性的保留。

3. 讨论

本研究旨在阐明自复制RNA负载的脂质纳米颗粒（LNP-RNA）在常用的储存条件下（通过低温保护剂浓度、缓冲剂类型和维持温度）发生的物理变化，以及这些差异与体内转染和疫苗效力的关系。我们在本研究中采用的特殊LNP配方包括两种可电离的脂质（TT3和Lin-MC3-DMA），我们发现这两种脂质在肌肉和体液免疫反应中结合起来能有效地进行转染，还有5mol%的DMG-PEG来补充接近中性的LNP的稳定性。使用这种配方，我们发现磷酸盐和三类缓冲液都适合储存LNPs，而蔗糖是一种重要的冷冻保护剂，可以维持repRNA有效载荷的结构完整性、物理稳定性或活性。最主要的因素是储存温度。

发现最佳的蔗糖浓度为10% w/v（图1），与其他已发表的生物材料的低温保护工作相似。蔗糖不是均匀地分散在整个样品中，而是在非冷冻状态下沿着脂质双分子层的表面形成一个薄片，并使材料不与冰直接接触。根据经验，10% w/v的蔗糖使这些过程能够有效地促进颗粒结构的保留而不发生聚集。

动态光散射（DLS）是一种常用于评估颗粒稳定性和流体力学尺寸分布的技术。然而，仅仅依靠DLS提供的散射数据在准确性方面可能会产生误导，特别是对于100纳米以下的多分散颗粒，强度和数量分布都不能提供准确的信息。因此，我们还进行了透射电子显微镜（TEM）和低温电子显微镜（cryo-EM），以充分捕捉LNPs从储存中解冻后的物理状态。有趣的是，在-20℃储存能够保持LNP的结构完整性，而从-80℃解冻颗粒后，观察到不可逆的聚集。其他研究也报道了LNP-mRNA配方在这些较低的温度下是稳定的（如BNT162b2的-70℃储存COVID-19疫苗）。我们假设携带repRNA与mRNA的LNPs之间的这些差异可能反映了RNA分子与纳米粒子中的脂质在分子水平上的包装结构的潜在差异或与mRNA与repRNA所用的N：P比率的差异相关的粒子稳定性的差异，导致对冷冻/解冻过程的不同敏感性。基于阿尔法病毒的自复制RNA比疫苗中使用的典型mRNA大10倍，并可能以不同于较短的mRNA的方式与LNP核心组织在一起。此外，我们采用了2:1的N:P比例将repRNA有效地包装在LNPs中，具有约90%的RNA封装效率和有效的体内输送，而文献报道相同的N:P比例可以将mRNA分子的封装效率降低到只有40%。此外，-80℃提供了一个介于-20℃缓慢冷冻和-200℃快速冷冻之间的中间地带。从室温冷却到-20℃预计会引起缓慢但短暂的冷却，产生分散在未冻结的液体和蔗糖片中的大冰晶（液体+冰相），而-200℃闪冻预计会瞬间形成固体冰，几乎没有冰核（固相）。相反，与-20℃相比，从室温冻结到-80℃预计会有一个加速的冷却速度，因为水能够在-40℃以下冻结而不成核。因此，所产生的状态将有一个较小的冰晶体混合的玻璃相，其中的颗粒和蔗糖分子都集中在其中。与大晶体相比，较小的冰晶体有更大的界面面积，这对低温保存是不利的。此外，颗粒在玻璃相中的集中可能进一步促进不稳定颗粒的聚集。因此，我们假设，加载了repRNA的LNPs在冷冻到-80℃或从-80℃解冻时更容易发生聚集，这是因为当加载repRNA而不是mRNA时，颗粒的独特结构特性和在这个温度和冷却速度下形成的冰相类型的混合。

LNP结构的维持（通过光散射和TEM的形态分析确定）不一定是储存后体内效力的可靠指标。例如，将LNP-RNA储存在4℃，根据DLS和电子显微镜的结果，与新制备的样品相比，能够保留颗粒的物理状态（表1和图3b和g），但在使用报告repRNA或编码抗原的repRNA进行活性研究时，未能发挥可靠的功能（图2和4）。这一结果表明，虽然4℃的储存环境足以使LNP保持完整，但封装的repRNA分子却受到负面影响。图5f-j中对解冻后保质期的测试结果进一步支持了这一观点，有效储存并解冻为4℃储存的疫苗，在4℃储存一天后，疫苗效力下降。为计算RNA分子的理论裂解率而进行的一项研究预测，一个4000个核苷酸的mRNA分子在无RNAse条件下储存在5℃时，其半衰期为941天，但更长的repRNA更容易被水解裂解。虽然这种反应在冷冻温度下并不令人担忧，但防止RNA降解是冷藏中必须的，尽管LNPs可能提供RNA分子的保护层；在我们保存在4℃的LNP-RNA样品中看到的功效下降和变化，可能是由于这种降解反应造成的。我们注意到的另一个现象是，虽然4℃储存能够保持相对较高的转染率（图2b和c），但其产生体液反应的下游功效却明显降低（图2i）。可能RNA序列对转染有影响，尤其是长的repRNA，其核苷酸序列的差异可能影响其在LNPs内的包装，进而影响其在冷冻和解冻过程中的稳定性。我们假设，在4℃储存后，RNA从颗粒中漏出，可能导致LNPs的内部包装结构发生变化，变成一种炎症较少的状态，或在注射部位送入细胞的repRNA减少，可能导致先天免疫反应减弱。

与4℃储存相比，闪冻到-200℃的LNPs在体内基因表达方面表现适中（图2），尽管这种储存方案在电子显微镜下显示出严重的聚集（图3e和j）。这种聚集可能是电子显微镜下样品制备步骤的结果--如在TEM的网格上干燥或在低温EM中经历另一轮闪冻。闪冻LNP-RNA的这种脆弱性或对解冻后处理的敏感性可能表明了未知的材料特性，而我们在新制备、4℃储存或-20℃储存的样品中没有观察到这些特性。再加上用于冷链运输的液氮维护是不切实际的，闪冻似乎不是一个合适的储存选择。

总的来说，在10% w/v蔗糖的PBS中的LNP-RNA疫苗在-20℃储存至少30天，物理上（图1、3c和h）和功能上（图2、4和5）都保持良好。对于我们的LNP-RNA系统，-20℃可能是一个足够高的温度，以提供一个理想的冰核温度和缓慢的冷却速度，以帮助保留颗粒结构，同时也是一个足够低的温度，以抑制RNA因水解裂解事件而降解。

一个更理想的解决方案是将LNP-RNA疫苗冻干为干粉状，并在室温下保持良好。然而，这一努力被证明是具有挑战性的，文献中几乎没有关于LNP-repRNA制剂冻干的成功报道。我们在图6中的结果显示，虽然几个参数的优化能够改善制剂的结构维护，但体内转染效果不如新制备的LNPs。可能是冷冻干燥的疫苗使RNA分子在再悬浮过程中更容易被降解或在体内与血清蛋白相互作用。最近，一种有效的冻干方法被报道，使用一个优化的冷冻步骤和两个独立的升华和解吸干燥循环，将mRNA疫苗以干粉形式稳定地储存在4℃，长达24周。

4. 结论

鉴于COVID-19的流行，疫苗的长期储存和冷链运输已成为成功转化和使用负载RNA的脂质纳米颗粒（LNP-RNA）的关键步骤。同时，我们逐渐意识到，关于LNP-RNA的物理特性、储存条件和疫苗效力之间的关系的信息非常匮乏。在这里，我们研究了疫苗在不同的储存条件下（通过低温保护剂的浓度、缓冲液的类型和储存温度）会发生什么样的物理变化，以及这些变化与体内疫苗效力的关系，同时使用编码报告蛋白（如荧光素酶）的RNA和实际HIV免疫原。最终，我们发现LNP-RNA疫苗在-20℃的PBS中以10% w/v蔗糖稳定地储存了至少30天。此外，我们发现携带复制体的LNPs也可以被冻干，并保留良好的体内生物活性。

文献来源：Kim Byungji, etc. Optimization of storage conditions for lipid nanoparticle-formulated self-replicating RNA vaccines. Journal of controlled release. 2022, 353: 241-253.