关于pipetty电动移液器在奶粉中叶酸测定（微孔板法）的应用

关于pipetty电动移液器在奶粉中叶酸测定（微孔板法）的应用

方案摘要：叶酸是鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值）。

方案详情：

一、实验原理

叶酸是鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。

二、实验准备

1、试剂和材料

①试剂

②培养基

③标准品

④标准溶液

注：本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。

2、仪器和设备：

①pipetty电动移液器，MSIC01-02-1000

②天平：感量为0.1mg和1mg

③恒温培养箱：36℃±1℃

④高压灭菌锅

⑤涡旋振荡器

⑥离心机:3000r/min

⑦接种环和接种针

⑧PH计：精度为±0.1

⑨组织粉碎机和研磨仪

⑩紫外-可见分光光度计或酶标仪

⑪超净工作台

⑫超声波振荡器

⑬13酶标仪

⑭离心管

⑮微孔板（无菌）

⑯滤膜（0.22μ）

⑰容量瓶

  注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，250℃干热1h～2h。

三、移取液体实验步骤

1、稀释：用pipetty电动移液器取无菌水加至96深孔板第1-3列，分别是400uL、300uL、200uL，然后依次加入试样100uL、200uL、300uL，对样本提取液进行稀释，使式样稀释液中叶酸含量在0.2ng/ml~0.3ng/ml范围内。

2、标液的稀释:用pipetty电动移液器取叶酸标准工作溶液0.00ｍＬ、0.05ｍＬ、0.1ｍＬ、0.2ｍＬ、0.3ｍＬ、0.00ｍＬ、 2.50ｍＬ、3.0ｍＬ、4.00ｍＬ和5.00ｍＬ，补水至1ｍＬ，混匀。

3、接种和培养：叶酸测定培养基高压灭菌冷却后，使用pipetty电动移液器仪器吸取含菌培养基150μＬ加入微孔板中。另吸取150μＬ标准系列管或试样系列管加入微孔板中，注：每次都需要更换新吸头，覆膜，混匀，置于36℃±１℃恒 温培养箱中培养32ｈ～40ｈ。

4、测定：混匀微孔板中培养物，用酶标仪在540ｎｍ处测定吸光度值。如果０对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。

注：适宜的测定光谱范围为540ｎｍ～610ｎｍ

四、结果

1、以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（cx），如果３支试样系列管中有２支叶酸 含量在0.10ｎｇ～0.80ｎｇ范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10％，则 可继续按式（1）、式（2）、式（3）进行结果计算，否则需重新取样测定。 试样稀释液的叶酸浓度按式（1）计算。

五、其它

1、一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

2、添加了叶酸的样品，称样量为1.0ｇ，稀释倍数为１时，检出限为0.5μｇ/100ｇ，定量限为1.0μｇ/100ｇ。