关于fluidot自动移液工作站在食品中叶酸测定（微孔板法）中的应用

关于fluidot移液工作站在食品中叶酸测定（微孔板法）中的应用

方案摘要：叶酸是一种对人体健康非常重要的维生素，特别是对妇女在怀孕前后和怀孕期间的摄入量非常重要。缺乏叶酸会导致神经管畸形等严重的先天性缺陷，因此，对食品中叶酸含量的检测和标准是非常有必要的。本方法利用96微孔板法快速测定食品（奶粉）中叶酸的测定。

方案详情：

一、实验原理

叶酸是鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。

二、实验准备

1、试剂和材料

①试剂

②培养基

③标准品

④标准溶液

注：本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。

2、仪器和设备：

①fluidot自动移液工作站，FDT-M24-12-1000

②天平：感量为0.1mg和1mg

③恒温培养箱：36℃±1℃

④高压灭菌锅

⑤涡旋振荡器

⑥离心机:3000r/min

⑦接种环和接种针

⑧PH计：精度为±0.1

⑨组织粉碎机和研磨仪

⑩紫外-可见分光光度计

⑪超净工作台

⑫超声波振荡器

⑬酶标仪

⑭96深孔板或离心管

⑮微孔板（无菌）

⑯滤膜（0.22μ）

⑰容量瓶

  注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，250℃干热1h～2h。

三、实验步骤 (所有操作均需避光进行）

1、式样制备：谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3ｍｍ～0.5ｍｍ）；肉、蛋、坚果等用均质器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀，也可采用冷冻干燥粉碎法混匀；液体试样用前振摇混合。上述制备的试样于２℃～４℃冰箱可保存１周。

2、式样提取：准确称取液体试样0.5ｍＬ～２ｍＬ，精确至0.001ｇ，转入锥形瓶中，加入80ｍＬ氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡0.5ｈ～４ｈ至试样完全溶解或分散，转入100ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。

3、将处理好的式样、96微孔板、标准溶液、无菌水、含菌培养液放置fluidot自动移液工作站的托盘与适配器中。

先将试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜（０.２２μｍ）过滤除菌，取8个吸头在96深孔板中分别加入１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ试样稀释液，补无菌水至５００μＬ。每个梯度做２个平行。

5、标准系列管配置：仪器自动取1个吸头分别加入叶酸标准工作溶液0.0uＬ、50.0uＬ、100.0uＬ、200.0uＬ、300.0uＬ、400.0uＬ、 500.0uＬ、600.0uＬ、800.0uＬ和1000.0uＬ，补水至1000.0uＬ，相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ｎｇ、 0.05ｎｇ、0.10ｎｇ、0.20ｎｇ、0.30ｎｇ、0.40ｎｇ、0.50ｎｇ、0.60ｎｇ、0.80ｎｇ和1.00ｎｇ，混匀。制备２套～３套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。

6、接种和培养：叶酸测定培养基高压灭菌冷却后，仪器自动取8个吸头，吸取150μＬ含菌叶酸测定培养基加入微孔板中。另吸取150μＬ标准系列管或试样系列管加入微孔板中，覆膜，混匀，置于36℃±１℃恒 温培养箱中培养32ｈ～40ｈ。注：每次都需要更换新吸头。

7、测定：混匀微孔板中培养物，用酶标仪在540ｎｍ处测定吸光度值。如果０对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。

注：适宜的测定光谱范围为540ｎｍ～610ｎｍ

四、结果

1、以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（cx），如果３支试样系列管中有２支叶酸 含量在0.10ｎｇ～0.80ｎｇ范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10％，则 可继续按式（1）、式（2）、式（3）进行结果计算，否则需重新取样测定。 试样稀释液的叶酸浓度按式（1）计算。

五、其它

1、一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

2、添加了叶酸的样品，称样量为1.0ｇ，稀释倍数为１时，检出限为0.5μｇ/100ｇ，定量限为1.0μｇ/100ｇ。