关于fluidot自动移液工作站在食品中黄曲霉毒素B1检测(ELISA法）中的应用

关于fluidot自动移液工作站在食品中黄曲霉毒素B1检测(ELISA法）中的应用

方案摘要：酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定 技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记 的抗原抗体反应 在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法 和间接法。

方案详情：

一、实验原理

试样中的黄曲霉毒素Ｂ１用甲醇水溶液提取，经均质、涡旋、离心（过滤）等处理获取上清液。被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素Ｂ1，与试样上清液或标准品中的黄曲霉毒素Ｂ1竞争性 结合特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色，经无机酸终止反应，于450ｎｍ 或630ｎｍ 波长下检 测。样品中的黄曲霉毒素Ｂ１与吸光度在一定浓度范围内呈反比。

二、实验准备

1、试剂和材料：配制溶液所需试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。 按照试剂盒说明书所述，配制所需溶液。 所用商品化的试剂盒需验证合格后方可使用。

2、仪器和设备：

①fluidot自动移液工作站，FDT-M8-4-300

②微孔板酶标仪：带450与630nm（可选）滤光片

③研磨机

④振荡器  SPP-SK-500

⑤电子天平：感量0.01g

⑥离心机：转数≥6000r/min

⑦快速定量滤纸：孔径11μｍ

⑧筛网：１ｍｍ～２ｍｍ孔径

⑨黄曲霉毒素Ｂ１试剂盒及所要求其它仪器

三、实验步骤 （在 20-24℃条件下操作）

1、称取至少１００ｇ样品，固体样品用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过１ｍｍ～２ｍｍ孔径试验筛。取５.０ｇ样品于５０ｍＬ离心管中；液体样品取１００ｇ待测样品摇匀，称取５.０ｇ样品于５０ｍＬ离心管中，加入试剂盒所要求提取液。

2、将处理好的样品与试剂盒中的96微孔板、标准品、酶标记物试剂、抗体溶液、显色剂、终止液放置fluidot自动移液工作站的托盘与适配器中。

3、仪器自动取1个吸头吸取标准或处理好的样品加50ul到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

4、仪器自动取8个吸头吸取稀释了的酶标记物加50ul到微孔板底部，丢弃吸头。

5、自动取8个吸头吸取抗体溶液加50ul到每一个微孔底部，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。在室温下（20℃-25 ℃）孵育30分钟，丢弃吸头。

6、倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将 250ul 洗涤缓冲液加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。

7、自动取8个吸头取基质/显色剂加100ul到微孔中，充分混合并在室温（20℃-25℃）暗处孵育 15 分钟，丢弃吸头。

8、自动取8个吸头取反应终止液加入100ul 到微孔中充分混合。混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入停止液后15分钟内读取光度值。

四、结果

1、酶联免疫试剂盒定量检测的标准工作曲线绘制

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素 B1 浓度（ng/kg）的 半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从标准曲线上读出。

请注意 ：为了获得样品中的黄曲霉毒素 B1 的实际浓度（ng/kg），从标准曲线上读出的浓度值。

2、待测液浓度计算

按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件，将待测液吸光度代入曲线图所获得公式，计算得待测液浓度（ρ）。

3、结果计算

食品中黄曲霉毒素Ｂ１的含量计算：

计算结果保留小数点后两位。

阳性样品需用第一法、第二法或第三法进一步确认。

4、精密度

每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。 其分析结果的相对相差应不大于20％。

5、其他

当称取谷物、坚果、油脂、调味品等样品5g时，方法检出限为１μｇ／kg定量限为３μｇ／kg。 当称取特殊膳食用食品样品5g时，方法检出限为0.1μｇ／kg，定量限为0.3μｇ／kg。