免疫组化简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应 和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。那么，显色常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP），常用的显色底物为DAB（3,3’-二氨基联苯胺），偶尔用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。碱性磷酸酶（AP或AKP）也是目前免疫诊断试剂最常用的标记酶之一，稳定性好、灵敏度高。表1. 免疫组化（IHC）显色系统的选择免疫组化注意事项1. 组织取材为避免蛋白丢失及组织受损引起的非特异试剂吸附，取材须快速（组织块也不宜太大）且要尽量避免人为损伤。2. 固定固定要及时、彻底，但也不能固定过久。实验证明甲醛固定时间越久的组织越容易出现自发荧光及非特异性染色。一般以 12~36 小时最好。3. 石蜡片与冰冻片的选择石蜡片制作对设备要求较冰冻片低，组织结构更好，保存条件简单时间也久。但对部分蛋白有较强烈的破坏作用，对蛋白保护较冰冻片差。冰冻片对蛋白的保护较石蜡片好，制作起来也较快。4. 灭活过氧化物酶（HRP）系统的一定要做内源性过氧化物酶的灭活，而对于碱性磷酸酶（AP）系统和免疫荧光这个步骤不需要做。5. 抗原修复不同的样本、不同的蛋白其最佳的抗原修复方式会有所区别，热修复（酸性修复液（柠檬酸盐修复液）、碱性修复液（EDTA 修复液）及酶修复（蛋白酶）都可做尝试。对于陈旧的样本要增加修复强度，比如延长修复时间。6. 封闭常用的封闭液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封闭液。血清应选择与二抗同源的血清。7. 抗体孵育一抗一定要与实验及样本匹配的，孵育条件以 4 ℃ 过夜最佳。二抗应匹配一抗，37 ℃ 孵育半小时即可。8. 显色DAB 显色建议在镜下控制反应时间，在阳性及背景之间选择平衡点。免疫组化常见问题分析1.脱片产生的原因有哪些  1、烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；  2、多聚赖氨酸玻片质量的问题。  3、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。  4、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。  5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。  6.组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。2.边缘效应1、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；2、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。3.切片染色后背景太深，如何区分特异性sing与非特异性着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。4.免疫组化染色呈阴性结果1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长；5、DAB孵育时间过短；6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。5.背景1、考虑一抗浓度高；2、然后调整DAB孵育时间；3、也要考虑血清封闭时间是否过短；4、适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

设计抗原时，对抗原的结构分析、B细胞表位预测尤其重要。1. 抗原的结构分析不同的蛋白类型，选择的方法需要多样性。大部分情况下，蛋白C端的亲水性、表面可及性和柔性都相对N端较好。蛋白的二级结构也是预测B细胞表位重要参数之一，β转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合，较可能成为抗原表位。而α螺旋和β折叠结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位。含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop区可能为功能性抗体的识别位点，特异性好，可及性强。2. B细胞表位预测的方法及应用线性表位的预测方法： B细胞表位的预测方法主要集中于线性表位，大量的预测B细胞表位的算法都是基于蛋白质序列。这些算法包括：蛋白质的亲水性算法、可及性算法、蛋白质可塑性算法、蛋白质二级结构预测算法、蛋白质抗原性算法。这些方法的代表软件有PEOPLE、PREDITOP、BEPITOPE、Bcepred、ABCpred、BepiPred、APP等。构象表位的预测方法：绝大多数B细胞表位预测方法都是基于蛋白质的一级或二级结构的，但这些方法只能用来预测由连续的氨基酸残基构成的线性表位，而基于蛋白质的三级结构来预测构象表位的方法比较少，这是因为各种抗原的构象表位可获得的数据要远远少于线性表位。基于蛋白质三级结构来预测构象表位的方法CEP：这是第一个以抗原蛋白的三级结构PDB文件作为输入条件，以构象性表位预测为主要目的的网上免费服务软件。由于抗原抗体之间的相互作用属于蛋白质与蛋白质之间相互作用中的一种，因此，可以参这些方法来预测B细胞表位。3. 抗原的表达系统的选择通过对抗原的结构和B细胞表位分析预测后，然后再结合抗体的使用要求，进行选择适当的区间以及表达系统进行抗原表达纯化。针对于简单的应用WB\IHC\IF\IP这类的检测应用型的抗体，我们推荐的是蛋白的成熟的非跨膜区间，表达系统可以选择大肠、酵母这种成功率高、经济成本相对于较低的蛋白表达系统，抗体的类型可以选择多抗和单抗。同时，这类型的抗体还可以选择直接合成多肽偶联载体后作为抗原，进行免疫动物。如果是正对与IF、FC、细胞、抗体结合等实验的话，我们推荐的蛋白是全长的或者成熟的跨膜和非跨膜区间，表达系统主要选择无细胞、哺乳、酵母这类具有蛋白活性或者能表达出全长的表达系统进行表达蛋白，对应的抗体类型主要选择单抗和基因工程抗体。

2023年8/9月，共计收录引用泽叶生物产品的文献11篇，总IF值67.6。其中IF值≥10的文章共2篇，最高IF值16.6。本期我们精选了5篇文献进行分享，简单介绍了主要的研究内容，旨在帮助科研人员了解最新研究进展及方向。高分文献精选（点击英文标题查看原文）01全血自动输注用自抗凝血海绵及其凝血因子失活机制Self-anticoagulant sponge for whole blood auto-transfusion and its mechanism of coagulation factor inactivation2023年8月12日，四川大学赵伟锋及纪海锋共同通讯在《Nature Communications》发表题为“Self-anticoagulant sponge for whole blood auto-transfusion and its mechanism of coagulation factor inactivation”的研究论文，该研究开发了一种羧化和磺化的肝素模拟聚合物修饰海绵，具有自发血液吸附和瞬时抗凝作用。由于海绵对凝血酶和钙消耗的多重抑制作用，该研究证明了全血自体输血在创伤性出血中的应用。研究证明了，在兔子模型中，与传统肝素化血液相比，输注采集的血液有利于更快地恢复止血。该项研究工作不仅开发了一种安全方便的全血自动输注方法，而且提供了自抗凝血肝素模拟聚合物修饰表面的作用机制。❖ IF=16.6❖ 作者单位：高分子材料工程国家重点实验室，四川大学❖发表期刊：Nature Communications❖ DOI：10.1038/s41467-023-40646-7❖ 所用泽叶生物·产品： Rabbit D-dimer ELISA Kit（点击产品名查看产品详情）文献相关图片左右滑动查看更多02纳米免疫增效剂增强小胶质细胞功能改善恶性胶质瘤免疫缺陷治疗Enhancement of Microglia Functions by Developed Nano-Immuno-Synergist to Ameliorate Immunodeficiency for Malignant Glioma Treatment2023年8月12日，复旦大学药学院胥敏俊教授团队在《Advanced Healthcare Materials》发表了题为“Enhancement of Microglia Functions by Developed Nano-Immuno-Synergist to Ameliorate Immunodeficiency for Malignant Glioma Treatment”的研究论文，研究了作为辅助治疗，合理设计的纳米免疫增效剂可以在使用或不使用替莫唑胺的情况下阻止恶性胶质瘤的进展和复发。这项工作证明了纳米制剂用于小胶质细胞免疫疗法的可行性，这可能为脑肿瘤的治疗提供新的方向。❖ IF=10❖ 作者单位：复旦大学药学院❖ 发表期刊：Advanced Healthcare Materials❖ DOI：10.1002/adhm.202301861❖ 所用泽叶生物产品：GL-261 GL-261-Luc+（点击产品名查看产品详情）文献相关图片左右滑动查看更多03用于特异性消耗和纯化癌源外泌体的原位捕获和计数装置In Situ Capturing and Counting Device for the Specific Depletion and Purification of Cancer-Derived Exosomes2023年8月23日，复旦大学于海龙等老师团队在《ANALYTICAL CHEMISTRY》发表了，题为“In Situ Capturing and Counting Device for the Specific Depletion and Purification of Cancer-Derived Exosomes”的研究论文，该研究开发了一种基于抗体功能化毛细管的原位外泌体捕获和计数装置。证明了MCF-7来源的外泌体诱导了上皮细胞MCF-10A的上皮-间质转变，并且我们的方法能够通过癌症外泌体的完全缺失或特异性缺失完全或部分逆转转变，而无需任何预处理。此外，模拟血液样本中的完整外泌体和单独的癌症特异性外泌体都被成功捕获和计数，没有明显的非特异性吸附。可直接从复杂的体液环境中实现了癌源性外泌体的原位消耗和计数，具有通过靶向血液透析和肿瘤源性外聘体计数提供全面的肿瘤治疗和预后评估工具的潜力。❖ IF=7.4❖ 作者单位：复旦大学❖ 发表期刊：ANALYTICAL CHEMISTRY❖ DOI：10.1021/acs.analchem.3c01670❖ 所用泽叶生物产品：MCF-10A MCF-10A专用培养基（点击产品名查看产品详情）文献相关图片左右滑动查看更多04副干酪乳杆菌发酵乳中ACE抑制肽的鉴定及原位分析Identification and In Silico Analysis of ACE-Inhibitory Peptides Derived from Milk Fermented by Lacticaseibacillus paracasei2023年8月14日，东北农业大学马春丽副教授等人，在《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》发表了，题为“Identification and In Silico Analysis of ACE-Inhibitory Peptides Derived from Milk Fermented by Lacticaseibacillus paracasei”的研究论文，该研究评估了副干酪乳杆菌M3菌株在脱脂乳发酵过程中产生ACE抑制肽的能力，并通过生物信息学分析研究了其抑制机制和稳定性。硅蛋白水解表明PWIQPK可以抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，表明它在消化道中相对稳定。所有结果表明，副干酪乳M3发酵的牛奶具有作为具有降压作用的功能性食品的潜力。❖ IF=6.1❖ 作者单位：东北农业大学❖ 发表期刊：JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY❖ DOI：10.1021/acs.jafc.2c09148❖ 所用泽叶生物产品：Sephadex G-15（点击产品名查看产品详情）文献相关图片左右滑动查看更多05VE钙粘蛋白对PD-L1的相互作用和调节介导间充质胶质母细胞瘤的血管免疫逃避Vascular Immune Evasion of Mesenchymal Glioblastoma Is Mediated by Interaction and Regulation of VE-Cadherin on PD-L12023年8月25日，上海交通大学医学院附属新华医院罗静老师等人，在《Cancers》发表了，题为“Vascular Immune Evasion of Mesenchymal Glioblastoma Is Mediated by Interaction and Regulation of VE-Cadherin on PD-L1”的研究论文，该项目研究了肿瘤血管形成和逃避免疫监测之间的机制联系。具有GBM转录物的临床数据集显示，间充质标记物YKL-40（CHI3L1）和波形蛋白的表达与PD-L1的表达升高和疾病存活率低相关。并且证明了mGBM促进肿瘤血管化和恶性转化的一种新的血管免疫逃逸机制。❖ IF=5.2❖ 作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院❖发表期刊：Cancers❖ DOI：10.3390/cancers15174257❖ 所用泽叶生物产品：HBMEC人脑微血管内皮细胞（点击产品名查看产品详情）文献相关图片左右滑动查看更多

苯酚抽提法非常简单，而且十分常见。特别是在提取基因组DNA时，要去掉许多从细胞裂解液中带来的蛋白，苯酚法十分好用。基本原理苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。苯酚抽提的具体步骤将同体积的苯酚和（DNA+蛋白）混合物溶液混合；苯酚和水溶液不互溶，所以分层，水层在上，苯酚层在下。快速震荡，让两层充分混合；静置让两液层分开，分离水层，在水层中得到的应该是大量的DNA和可能少量的蛋白质。苯酚抽提的优缺点优点有效变性蛋白质抑制了DNase的降解作用缺点能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly (A)RNA不能完全抑制 RNaseDNA提取的注意事项1. 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。2.酚一定要碱平衡，使用平衡饱和酚。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。3.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。4.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。5.异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。6.提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。7.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。8.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。9.要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。10.避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。11.吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。12.在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。13.加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。14.加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA。15.将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。16.在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。17.酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。

‍‍细胞培养被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。 支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。 支原体的污染来源（1）细胞之间交叉污染；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；（3）工作环境或实验器材的污染；（4）培养基的污染。支原体污染的检测及鉴定方法 01、培养法  培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。（一）材料与设备1. 精氨酸肉汤培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制， 高压除菌（加20％胎牛血清）。2. 支原体琼脂培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。3. 其他   超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。（二）操作步骤1. 样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测， 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃） ，每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。（三）结果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀02、荧光染色法  荧光染色法检测支原体污染是利用荧光染料进行支原体污染的拣择方法。荧光染色法检测支原体污染的基本原理用特异荧光染料（Hoechst 33258）染色后在荧光显微镜下进行检测。荧光染料（Hoechst 33258）是一种能和 DNA 特异结合物质。如果，检测样品为支原体污染，则附在细胞表面的支原体 DNA 着色，在荧光显微镜下可见。（一）材料与设备1. DMEM 完全培养基及无抗生素的 DMEM 培养基2. 二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）3. 固定液4. 细胞培养 6 孔板或其他容器5. 荧光显微镜6. 二氧化碳培养箱（二）操作步骤1. 盖玻片培养细胞汇合前从瓶中取出；细胞最好处于 70％ 汇合，如细胞完全汇合，能影响支原体的观察。2. 漂洗将细胞盖片置于培养皿中，用不含酚红的 Hanks 液漂洗；细胞悬液则先离心去上清营养液后，再加入 Hanks 液漂洗。3. 固定加入固定液 5 ml，放置 10 min。4. 漂洗用生理盐水或去离子水漂洗，方法同（2）。5. 染色加入二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）工作液 5 ml，在室温下放置 10 min。6. 观察取出盖玻片空气中干燥，细胞面向上，滴加 pH5.5 的磷酸缓冲液数滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜下观察。（三）注意事项1. 盖玻片培养细胞达到 70% 汇合观察效果最佳，不要使细胞完全汇合。2. 在空气中干燥时，盖玻片的细胞面向上。03、PCR法  该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。PCR 法检测支原体污染的基本原理是酶促 DNA 合成反应，即在 DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经 DNA 聚合酶的作用，使 DNA 链扩增延伸。（一）材料与设备1. 支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean 树脂、缓冲液；）2. dNTP3. Taq DNA 聚合酶4. 缓冲液5. 琼脂糖6. 矿物油7. 超净工作台8. PCR 仪9. 电泳仪10. 凝胶成像分析系统11. 台式离心机12. 旋涡混悬器（二）操作步骤（1）样品的收集待测细胞用无双抗培养基培养 7 d，用无菌容器取上清液 500 μl，4 ℃ 保存待测。（2）模板的制作在无菌的条件下，取细胞培养上清液 100 μl 于一无菌的 0.5 ml 塑料离心管内，盖好盖子，95 ℃ 水浴加热 5 min。（3）打开盖子，向管内加 StrataClean 树脂 10 μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心 5～10 s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4 ℃ 保存。（4）PCR 反应反应体系最适条件为：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.38），50 mmol/L KC1，1.5～2.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，2U Taq DNA 聚合酶；总反应体系为 50 μl，反应用去离子水均需用 12000 μJ/c㎡紫外灯照射。A. 在 0.5 ml 塑料离心管中加入 35.2 μl 去离子水及 5 μl 10 x Taq 反应缓冲液。 B. 依次加入下列成分：0.4 μl dNTP（25 mmol/L）；0.4 μl Taq 酶（5 U/μl）；2 μl 引物。C. 加 2 μl 去离子水，总体积 45 μl。D. 加 5 μl 已制成的模板到反应体系中。E. 阳性对照、内对照各 5 μl 加入到各自的反应体系中。F. 取 1 支含有以上反应体系的离心管，加入 5 μl 去离子水作为阴性对照管。G. 在反应体系中加入 100 μl 矿物油。H. PCR 程序：程序循环数/次温度/℃时间/min程序循环数/次温度/℃时间/min11942240941502501722722（5）琼脂糖凝胶电泳PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度 2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。 （三）注意事项1. PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。2. 检测前，待测细胞要用无双抗培养基培养 7 d。04、扫描电子显微镜法  扫描电子显微镜法：扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。（一）原理利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞中支原体污染情况。 （二）材料与设备待检测细胞， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（ pH7.4 ) ，扫描电镜及相关设备。（ 三）操作步骤1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。3. 以PBS 洗涤3 次。4 . 以2 .5％戊2醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。5 ．以1％锇酸固定30min, PBS 洗涤。6 . 乙算异戊酯脱水。7. CO2 冰点干燥。8. 喷金。9 . 扫描电镜观察，照相。 （四）结果分析以上就是小编整理的四种支原体检测方法，希望对大家细胞培养能有所帮助。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。同时预防支原体的污染也很关键。这期内容就到这里结束啦！‍‍‍‍

题目：Enhancement of Microglia Functions by Developed Nano-Immuno-Synergist to Ameliorate Immunodeficiency for Malignant Glioma Treatment杂志：Advanced Healthcare MaterialsDOI：10.1002/adhm.2023018612022 SCI IF（影响因子）：10.0文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202301861摘要：驻留小胶质细胞是介导抗脑肿瘤免疫的关键因子，但恶性胶质瘤中的小胶质细胞功能受损。小胶质细胞抗胶质瘤功能恢复的免疫治疗方法尚不多见。在这里，齐墩果酸(OA)(小胶质细胞“恢复剂”)和DPPA-1肽(免疫检查点阻断剂)被整合在纳米免疫增效剂(DPAM@OA)上协同工作。自组装的OA核心包被巨噬细胞膜，有效穿透血脑屏障和靶向小胶质细胞，DPPA-1肽通过酸敏感键附着在其上，在肿瘤微环境中特异性释放。随着双药在各自作用位点的积累增强，DPAM@OA通过抑制小胶质细胞中STAT-3通路的异常激活，有效促进效应T细胞的募集和激活，并通过阻断恶性胶质瘤中升高的免疫检查点蛋白，协助激活的效应T细胞杀伤肿瘤细胞。最终，作为辅助治疗，合理设计的纳米免疫增效剂可以阻止恶性胶质瘤的进展和复发，无论是否使用替莫唑胺。本研究证明了小胶质细胞免疫治疗纳米制剂的可行性，为脑肿瘤的治疗提供了新的方向。

报告基因（Reporter Gene）：通常指可编码某种蛋白或酶，其表达产物容易被检测，并且能与内源性背景蛋白相区别的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)；一、原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。二、技术流程：（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。 

H9C2细胞描述大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好 的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。                                                       CCC细胞库H9C2细胞图片H9C2细胞培养实验准备提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头（白色0-10ul；黄色20-200ul；蓝色100-1000ul）、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。试剂：DMEM培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素。H9C2细胞培养条件培养基：90%DMEM+10%FBS+P/S生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃传代方法：1:2至1:3，每周 2-3次冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存H9c2 （2-1）细胞培养操作H9c2 (2-1）复苏操作方法1.将含有1 mL H9c2 （2-1）细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。2.在1000 rpm条件下离心5 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。3.然后将所有H9c2（2-1）胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。H9c2（2-1）细胞传代处理如果H9c2 （2-1）细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗H9c2（2-1）细胞1-2次。2.加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有H9c2 （2-1）细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。3.将H9c2（2-1）细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。H9c2（2-1）细胞冻存操作待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例1.收集H9c2（2-1）细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。2.根据H9c2（2-1）细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。H9c2（2-1）细胞培养注意事项1.H9c2（2-1）细胞溶解过程要迅速，已溶解的冻存细胞不能在常温下存放太久，需要尽快离心去除DMSO。2.H9c2（2-1）细胞冻存时，尽量吹散细胞，注意控制吹打力度。H9c2细胞常见问题及解答为什么H9c2细胞培养会出现细胞表面颗粒较多的现象？可能是培养环境有问题，可以改用DMEM/F-12培养基培养，传三代后会恢复平整细胞表面。H9C2细胞可以传几代？细胞系是可以传代的，理论上是可以无限传代的，也就是永生化细胞，但是研究发现细胞系也会有老化的；收到细胞后自己具体可以传多少代，会受到客户自己养细胞的操作水平技术，操作环境，用的试剂耗材的质量等因素影响的。为什么H9c2细胞培养会出现空泡？可能是铺板时铺得不够均匀，局部过于密集，密集地方的细胞就开始状态变差、空泡增多。也可能是血清差，需要更换优质血清，及时换液。为什么H9c2细胞培养长得慢？这些因素都会影响细胞长得慢：1.没有保证密度，细胞长不起来，可以先培养，然后消化重新铺瓶，提高密度培养2.操作时力度没控制好，将细胞吹碎，状态变差3.血清质量不好，影响细胞生长为什么H9c2细胞状态变差，容易漂？可能是血清问题，建议换血清，并注意血清要程序解冻，不能水浴化开；也有可能是细胞生长密集，需要及时传代，并不是细胞长满才传代，当有个别地方长得过于密集，容易叠加的时候应该就要传代了。是否可以在 H9C2 细胞系中诱导细胞肥大？据报道，血管紧张素 II、异丙肾上腺素、内皮素-1、胆固醇（甲基-β-环糊精）、晚期糖基化终产物、去氧肾上腺素、菲、地塞米松、葫芦素-I、溴酸钾、抵抗素、高葡萄糖等可诱导大鼠细胞肥大胎儿心肌细胞 H9c2。测量 H9C2 细胞大小的最佳染色技术是什么？可以使用小麦胚芽凝集素 （WGA） 。它可染色细胞膜表面的糖蛋白，并可染色心肌细胞中的 t 小管 （Savio-Galimberti 等人，2008）。H9C2 细胞培养无小事，在培养过程中，每一步操作都要轻柔小心，以免细胞受损；选用优质培养基，减少有害物质对细胞的刺激。

英文名称：Chinese Hamster Ovary;cho发现人：Theodore T. Puck 发现时间：1957年产地：中国   形态：成纤维细胞样组织来源：卵巢 生长特性：贴壁细胞 CHO细胞又称中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系。       中文名称中国仓鼠卵巢细胞英文名称Chinese Hamster Ovary；cho      发现人Theodore T. Puck发现时间1957年      产地中国细胞形态成纤维细胞样      组织来源卵巢生长特性贴壁细胞　>>>> CHO细胞简介　　CHO细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO), CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。　　>>>>  历史及种类　　CHO细胞最早由Puck实验室在1957年分离，通过将0.1g中国仓鼠卵巢组织酶解消化获得。酶解后大部分细胞属于成纤维细胞，在进行超过10个月的体外培养后，细胞并未表现出普通二倍体细胞的Hayflick界限，仍然可以继续分裂生长，但是细胞形态从最初的成纤维细胞转变成近上皮细胞的形态。1958年Puke实验室将此连续传代细胞进行重新克隆后，建立了我们现在所用的CHO细胞最原始细胞系。　　这个最原始的CHO细胞系是脯氨酸缺陷型的，必须在培养基中添加额外的脯氨酸以支持其生长，目前所有已知的CHO细胞系均保留了这个特性。这个最原始的CHO细胞系后来流转到不同的实验室和公司，经过不同的培养、驯化、改造和重新克隆后形成了不同种类的CHO细胞系。这些细胞系虽然都是来源于最原始的CHO细胞系，但由于CHO细胞基因组内在的不稳定性及后续不同实验室的筛选培养条件不同，不同CHO细胞系之间的形态、生长、表达、代谢、甚至基因组都有较大差异，下面就几种常用的CHO细胞系进行描述。 CHO-K1　　CHO-K1是未经改造的野生型CHO细胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的实验室将原始CHO细胞系的一个亚克隆存放于ATCC(CCL-61)，并命名。随后源于ATCC CHO-K1的一个亚克隆在1985年被分离，并保存于ECACC(85051005)，并被制药公司和CMO公司用作重组蛋白的表达。最原始的CHO-K1细胞是贴壁培养，并需要添加血清，由于血清的批间稳定性问题，及后来病毒安全性问题，无血清悬浮培养成为趋势。其中Lonza公司从ECACC获得CHO-K1驯化到悬浮无血清培养后，建立CHO K1 SV(Lonza，2002)细胞株，并广泛应用于其GS表达平台。Merck(原SAFC)也是从ECACC获得CHO-K1细胞株，并悬浮驯化至化学成分限定培养基中，形成了CHOZN® CHO K1(Merck，2006)细胞株。　　基于CHO-K1细胞的表达平台多采用GS(谷氨酰胺合成酶)筛选系统和/或抗生素筛选系统。采用GS筛选系统的平台可在转入目的蛋白基因的同时转入GS基因，在筛选阶段采用不含谷氨酰胺的培养基进行筛选。但由于CHO-K1细胞具有内源的GS基因，因此在筛选时往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同时筛选，以提高筛选效率。此外，由于内源GS基因的存在，筛选出的高表达克隆往往稳定性较差，需要进行充分的稳定性评估后，方可用于后期的工艺开发及规模化生产。而单独采用抗生素进行筛选的平台，因筛选效率较低，多用于研究阶段。目前多个已经上市的治疗性蛋白是基于CHO-K1细胞进行开发生产的。　　 CHO-S　　基于原始的CHO细胞系，1973年Thompson实验室分离了一株可用于悬浮培养的CHO细胞，并将此细胞命名为CHO-S。虽然都来源于最原始的CHO细胞系，但从细胞历史分枝上看，CHO-S和CHO-K1分属于不同的代系。此细胞系在1980年代后期提供给当时的Gibco公司，后者将此细胞驯化至CD CHO培养基中，建库并以CHO-S名称进行推广。因其能在无血清培养基中悬浮生长，并支持高密度培养，在早期常被用作瞬时表达宿主细胞。此后，相应的GMP细胞库被建立，并支持商业化授权开发。　　 CHO-DXB11　　CHO-DXB11(又名DUK-XB11)是由哥伦比亚大学的Urlaub和Chasin在1970-80年代通过伽马射线诱变的方法获得。CHO-DXB11细胞的双等位基因中，一个DHFR基因被敲除，另一个DHFR基因仅包含一个错义突变(T137R)，这使得此细胞不能有效还原叶酸而合成次黄嘌呤(H)和胸苷(T)。在表达外源重组蛋白时，将外源的DHFR基因和目标蛋白基因同时转染细胞，并通过缺乏HT的培养基进行筛选。由于DHFR基因可以通过重组重排进行基因扩增，在适当的MTX压力下，可以通过DHFR基因的扩增同时获得目标蛋白基因的扩增，从而获得更高表达的稳定表达细胞株。在早期CHO细胞培养时通常需要加入血清，因此在当时的细胞筛选protocol里面经常会看到用透析血清来避免引入HT或其它核酸代谢底物。此外需要指出的是，CHO细胞平台上第一个被批准上市的tPA就是采用DXB11做为宿主细胞，并且此宿主细胞被Genentech用于后续的多个商业化产品生产。　　 CHO-DG44　　由于DXB11细胞中仅有一个等位基因被敲除，在长期传代过程中，会发生低几率的突变使宿主细胞重新恢复DHFR基因活性，造成筛选压力的下降甚至导致重组蛋白表达量的下降。因此，获得一个双等位DHFR基因完全敲除的宿主细胞成为一个需求。Chasin实验室先后通过化学诱变和伽马射线诱变，最终在1983年筛选出了双等位DHFR基因敲除的CHO宿主细胞，并命名为CHO-DG44。虽然和DXB11都属于DHFR基因缺陷型，但从谱系分枝来看，DG44和CHO-S更为接近。因为DG44细胞完全缺失了DHFR基因的活性，并且可以无血清悬浮培养，使得筛选和加压过程变得更加有效。目前多家公司及CDMO企业采用此细胞做为平台进行治疗性蛋白的开发，已经有多个产品进入临床及上市阶段。　　 CHOK1SV GS-KO　　Lonza在其CHOK1SV细胞的基础上，与Cellectis 合作并利用后者的Meganucleases技术将CHOK1SV细胞中GS的双等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO细胞株。由于内源性的GS基因被完全敲除，大大提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期(相比CHOK1SV系统缩短了6周)，同时提升了最终克隆的稳定性。基于GS-KO细胞的GS Xceed表达平台除包括宿主细胞株外，还包括相应的质粒及V8培养基系统。GS Xceed已经在全球用于多个产品的开发，并向全球授权(Lonza一代CHOK1SV不给中国授权)。但由于V8培养基系统相对复杂，多数CHOK1SV/GS-KO客户并未采用其培养基系统。　　 CHOZN GS　　Merck(原SAFC)于2006年通过ECACC获得CHO-K1细胞株，并将其驯化至化学成分限定培养基CD Fusion中，然后进行亚克隆建立CHOZN CHO K1细胞系。在此细胞系基础上，通过ZFN(锌指核酸酶)技术敲除GS双等位基因，获得GS缺陷型细胞株CHOZN GS，并于2012年推向市场。整个平台除细胞株外，还包括质粒、克隆构建阶段用的培养基及流加工艺平台培养基。通过平台化的培养工艺进行细胞筛选，可将稳定细胞株构建及上游工艺开发周期缩减到18个星期。目前以CHOZN GS做为宿主细胞的多个项目已经在全球多个国家推进到临床实验阶段。　　 Others　　除了上述在工业界应用较多的细胞系外 ，还有其他一些CHO细胞系也在应用。　　如在欧洲应用比较多的Selexis公司SURE CHO-M细胞株，其源于ECACC CHO-K1细胞系，并经驯化后获得，Selexis表达平台同时运用MARs元件来提升筛选效率和目标蛋白表达量，运用CHO-M的多个项目已经推进到临床实验阶段并有一个分子获得批准上市。　　Horizon的HD-BIOP1(GS Null CHO-K1)也是源于ECACC CHO-K1细胞系，通过rAAV技术将双等位GS基因敲除，获得GS缺陷型细胞，但由于基因编辑实验过程中部分实验关键材料记录不全而引起监管机构的担心，Horizon试图通过全基因组测序来消除监管机构的担心，但由于基因组数据过于庞大以及现在对整个基因组数据的解读尚需时日，目前为止尚未在欧美国家获得临床实验批准。　　 >>>> CHO细胞特性　　CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别:动物细胞比微生 物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差;倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素;培养过程需氧量少;培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在，原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。　　 >>>> CHO细胞结构　　具有不死性，可传百代以上，是生物工程广泛使用的细胞系　　属于成纤维细胞，可贴壁培养，经多次传代筛选后也可悬浮培养　　一种非分泌细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化十分有利　　形成有活性二聚体，具有糖基化功能，是表达复杂生物大分子的理想宿主　　 >>>> CHO细胞培养　　可在人工控制条件的生物反应器中大规模培养　　比微生物细胞更大，无细胞壁,机械强度较低，对剪切力敏感，环境适应能力差　　配增时间长，生长缓慢，易受微生物污染　　培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在　　培养过程需氧量少，代谢产物具有生物活性，生产成本高　　 >>>> CHO细胞表达系统优点　　具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白分子在分子结构.理化特性和生物学功能更接近天然蛋白分子　　具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化　　具有重组基因的高效扩增和表达能力　　具有贴壁生长特性，可以进行悬浮培养，具有较高的表达能力　　 >>>> CHO细胞的一些问题　　构建重组CHO细胞生产效率低，产物浓度也低　　某些糖基化表达产物不稳定，不方便纯化　　重组细胞上游构建与下游分离纯化脱节,主要表现在，上游高效表达与下游有效提取之间的矛盾　　重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下　　 >>>> CHO细胞展望　　随着以CHO细胞为主的动物细胞表达系统日益完善,动物细胞将成为基因工程药物的主要宿主细胞.研发人员将对以下问题进行主要研究　　1.提高表达水平，如发展些新的强启动 子，装配适合于高效表达的必要元件　　2.在提高表达的同时,注重下游分离纯化，如改变中的个别序列，使表达产物在不影响生物活性的前提下携带有利于分离纯化的基团　　3.细胞培养成本的控制，高密度高产量和培养设备的大型化自动化和精窍化　　4.分离纯化的低成本和高活性回收率

悬浮细胞在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究等领域应用广泛，例如在血液粒细胞的研究中，THP-1细胞就是一个非常经典的细胞模型，在细胞免疫治疗方向，NK92细胞更是发挥了必不可少的作用，还有HL-60、K562、U937、U266等都是我们在实验室比较常见的悬浮细胞。在悬浮细胞的培养过程中，根据整体细胞生长分裂的状况可以将整个细胞培养周期分为四个时期：潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期。对数生长期的时候是细胞分裂最旺盛的时候，细胞活性也是最高，随着分裂次数的增加，细胞代谢产物增加，细胞密度增大，到了对数生长期后期有一小部分细胞会出现凋亡的迹象。进入稳定期后细胞密度达到最大，如果这个时候不及时补充营养更换新鲜培养基的话凋亡的细胞就会越来越多，即死细胞越来越多。如果死细胞太多的话会影响降低整体细胞活性，同时也会抑制影响正常细胞的生长代谢。如果涉及药筛实验等，死细胞比例更会大幅增加，以下，是泽叶给大家整理的史上最全的悬浮细胞去死细胞的方法！快快查收！1.磁珠标记MACS(magnetic-activated cell sorting),原理就是用结合了磁珠的抗体去标记细胞，让目的细胞带上磁珠，也可以正向选择死细胞，通过磁场将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。MACS是细胞分选的重要手段，优点是细胞活性好，缺点就是能分选的细胞类型有限，且成本较高。2.流式分选FACS（fluorescence-activated cell sorting），也就是流式分选，与流式分析一致。利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。3.活细胞短暂贴壁法可以用一种叫Con.A（刀豆球蛋白）来包被培养皿或培养瓶，悬浮细胞中的活细胞可短暂贴壁，此时弃去上清，一段时间后，细胞又可以重新悬浮。市面上有一些经过特殊处理的养贴壁细胞的培养瓶也可达到这种效果，但是建议使用之前根据所养的悬浮细胞生长状况测试一下分离效果。4.沉降法部分悬浮细胞如NK92成团生长，成团的细胞状态较好，单个细胞基本没有增殖能力，根据这一特性，便可以将细胞悬液收集在离心管中，注意动作要轻柔，不要将细胞团吹散，将离心管直立，观察离心管底出现“白雾”层时，可小心将上清去除，来收获状态良好的细胞团。5.低速离心法一般来说，悬浮细胞中的死细胞及细胞碎片的密度相对较低，此时，可以通过低速（500-800rpm）来去除一些上清中的死细胞，每次传代或换液进行此操作，使活细胞有生长优势，可以慢慢提高活细胞比例。

血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成(称为必需氨基酸)，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等)；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。常用血清种类目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用兔血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用兔血清、马血清等其他血清。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。常见血清及规格胎牛血清：(八月龄胎牛心脏穿刺取血)适用于细胞株保藏及娇贵细胞培养。超级新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，采血后静置自然析出的血清)适用于淋巴细胞、骨髓瘤细胞、二倍体细胞等基础生物医学研究。标准新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，经离心分离的血清)BVDV 抗原抗体均阴性，适用于原代、传代细胞培养和人用疫苗(vaccine)生产和研制。特别适用于猪瘟疫苗(vaccine)的研制、生产。普通新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，融血或微融血的血清)适用于普通原代、传代细胞培养和兽用疫苗(vaccine)及诊断试剂生产小牛血清：(出生三月龄小牛动脉采血分离血清)适用于生物医学研究等。大牛血清： 适用于标准蛋白液、胆固醇液及牛血清白蛋白制备等。马血清： 适用于兽用疫苗(vaccine)生产和诊断试剂生产。山羊血清：适用于生物医学研究基础等。血清质量的差异性大如何选择市场上各种血清产品鱼龙混珠，一不小心，你可能就使用了品质不好的血清。血清按照采血时间可分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的优劣顺序为：胎牛血清>新生牛血清>小牛血清。一般细胞建议使用胎牛血清培养，部分细胞可使用新生牛血清培养，小牛血清则不建议用于细胞培养。血清在生产中受采血来源，条件和生产工艺等的影响，质量差异较大，即使相同厂家不同批次的血清都会有差异;另外不同种类的细胞对血清的适应也有不同，这可能与血清中所含的生长因子有关，所以血清在使用之前应提前验证一下对所培养的细胞生长的促进作用。培养细胞用的培养基为人工合成，但动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，加入动物血清是为了给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育主要作用有a、提供基本营养物质或合成培养基所缺乏的营养物质：如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等；b、提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子;c、提供贴壁细胞所需的贴壁因子和扩展因子;d、对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使细胞免受蛋白酶的损伤;e、血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用;f、血清中的结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。细胞培养中如何正确使用和保存血清保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷冻保存，使用之前应先放到2~8℃冰箱过夜溶解，不建议直接放到室温或37℃水浴溶解(升温过快会导致血清中蛋白质大量沉淀，影响血清质量);若一次使用量不多，可溶解后分装至小包装冻存，避免反复冻融。血清解冻后在2~8℃保存时间一般不超过一个月。灭活：一般血清使用时不需要灭活。灭活的作用是消除血清中的各种补体成分，但事实证明血清灭活之后会产生大量的沉淀，会对血清的营养物质造成较大破坏，对细胞的生长不利。沉淀：血清中的沉淀一般为析出的纤维蛋白，另外新生牛血清中各种蛋白含量明显偏高，溶解时较易产生大量沉淀。血清中出现沉淀一般不会影响血清质量，并且升温至37℃时会溶解(不建议加热血清);若沉淀量较多，可在400×g离心3min，取上清使用。血清和添加了血清的培养基在使用时不需要过滤。血清使用中可能遇到问题a、如何更换使用血清需要更换使用不同品牌或批次的血清之前，需提前对要使用的血清进行验证，可使用自己经常培养的细胞进行，保证该血清对细胞生长的促进作用。在更换使用时可以将要更换的血清和原本使用的血清1:1混合使用1~2代，待细胞完全适应后进行更换。b、血清颜色的问题血清颜色主要是黄色或红色，一般淡黄色或微红色为正常。这个主要受血红蛋白含量的影响，若颜色太深(接近培养基的颜色)，则有可能是采血过程中出现溶血导致的。c、血清沉淀的问题血清中的沉淀主要是纤维蛋白凝集产生的，一般来说每次冻融都会产生一部分的沉淀，但不影响血清质量和使用。另外，血清在加入到培养基中后也是有可能会产生沉淀的，特别是灭活后的血清，会持续产生黑色颗粒，这可能会被错误判断为污染。一般血清产生的沉淀在显微镜下观察为微小的不规则絮状或者颗粒物质，排查是否为污染最好的办法是用琼脂板检测。

细胞培养过程中，细胞生长减慢要怎么处理【可能原因】① 由于更换不同培养液或血清② 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏;③ 培养物中有少量细菌或真菌污染④ 试剂保存不当⑤ 接种细胞起始浓度太低⑥ 细胞已老化⑦ 支原体污染【解决方法】① 增加起始培养细胞浓度。让细胞逐渐适应新培养液② 换入新鲜配制培养液。或补加谷氨酰胺及生长因子③ 用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌④ 血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8 ℃保存，并在2周内用完⑤ 增加接种细胞起始浓度⑥ 换用新的保种细胞⑦ 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物

细胞培养过程中，细胞死亡怎么处理细胞培养过程中，细胞出现死亡怎么处理【可能原因】① 培养箱内无 CO2② 养箱内温度波动太大③ 细胞冻存或复苏过程中损伤④ 培养液种有毒代谢产物堆积⑤ 培养液渗透压不正确【解决方法】① 检测培养箱内CO2② 检查培养箱内温度③ 取新的保存细胞种④ 换入新鲜培养液⑤ 检测培养液渗透压

污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃。 决定要进行细胞培养，首先-定要有强烈的无菌意识，操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好。一般情况下，如果你的细胞被细菌污染了，培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化，表现为胞浆中出现大量的颗粒，液体浑浊、培养基PH下降，变成黄色，贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡；而受到真菌污染的细胞，细胞状态并不会马上发生变化，培养3-4天后，可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿。常见细胞培养污染判别真菌污染真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。细菌污染污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。支原体污染支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3-0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。细胞培养的支原体污染来源主要有(1)细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；(2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；(3)细胞培养用的组分，如血清、培养液等；黑胶虫污染黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。常见细胞培养污染判别及应对措施细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、支原体、黑胶虫、病毒和交叉污染等，每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。下面就具体看看每一种污染。 1. 细菌污染(较容易被发现)引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；细菌污染种类：白色葡萄球菌，大肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；细胞污染后的变化：①污染后由于有大量酸性物质产生，因此培养基会短时间内由红色变为黄色；②由于细菌大量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物；③普通倒置显微镜高倍镜观察，胞浆内可见大量颗粒(如下图红色箭头)；④细胞生长缓慢，逐渐变圆脱落。如下图所示：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远大于杆状细菌，而细菌呈黑色颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。细菌污染的细胞(左悬浮细胞，右贴壁细胞)处理措施：在培养液中添加双抗(P/S)处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；另外添加西司他丁钠和亚胺培南(泰能)处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况。裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。 2. 霉菌污染(较容易被发现)引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；污染种类：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；细胞污染后的变化：①一般来说，培养液不会变浑浊；②比较容易发现，肉眼可见点状菌落(淡黄色或者白色)漂浮在培养基表面(如下图左)；③普通倒置显微镜下观察，可见絮状交错的菌丝或菌团生长在细胞之间；有时真菌并不是直接分布于细胞贴壁层，需要通过调整显微镜仔细观察寻找菌丝或菌团(如下图右)。如下图所示：悬浮细胞U397的霉菌污染，黄色圆形发亮的是U397；红色箭头：霉菌的菌丝和孢子囊，特别的是孢子释放出来后是难以被酒精杀死。霉菌污染后的悬浮细胞处理措施：添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。 3. 支原体污染(难被发现)支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤器，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高[3]。由于支原体可以与细胞共存，生长速率受影响较小，而被忽视。支原体污染在细胞培养污染中最为隐蔽和最难察觉，但是支原体能明显影响宿主细胞代谢、RNA合成及基因表达的作用，因此越来越受到重视。引起原因：主要来源于是已感染支原体细胞之间的交叉污染，支原体感染的血清和胰酶等；细胞污染后的变化：①培养液不变浑浊，但会很快变成黄色；②多数细胞在形态方面少有明显变化；③在倒置显微镜下可见胞浆出现小颗粒或空泡；如下图：支原体个体很小，需要使用透射电镜才能清晰看到其结构及分布，图中红色箭头即为支原体，其分布在细胞周围。支原体污染后的透射电镜图处理措施：定期用支原体试剂盒检测；换液可以减缓污染情况，但无法根除；支原体清除试剂盒可以达到较好效果；小鼠腹腔巨噬细胞清除法。 4. 黑胶虫污染引起原因：往往来源于血清；细胞污染后的变化：①低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可见到其做布朗运动，像小虫游来游去；②细胞培养液仍然清亮，污染较轻时对细胞无影响；若太多就会对细胞造成影响。如下图：红色箭头所示黑胶虫分布于细胞间。黑胶虫污染后的细胞处理措施：更换血清；增加细胞密度，提高细胞的生长率。 5. 病毒污染引起原因：病毒可能来自于血清；细胞污染后的变化:①污染后培养液无明显变化；②大部分细胞也不会有明显的形态变化； 6. 交叉污染引起原因：两种或两种细胞以上的实验同时进行，实验器具、试剂等混用而易造成的污染；检测手段：可通过镜检观察细胞形态是否与所培养细胞形态一致来判断，另外还可以通过各种免疫学试验、同功酶分析及细胞遗传学方法来确定。处理方式：针对病毒和交叉污染较难清除，建议丢弃细胞重新培养； 看到这里，文章开头的那几张图片代表着什么污染，你能辨别了吗?可以在下方给我们留言，看看你是否掌握了这项技能哦!学会对各种污染情况的辨别和处理是一项不可或缺的实验技能，希望大家在看完我们的文章后结合你的实验操作，学会如何应对细胞污染。 参考文献1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究[J]. 第二军医大学学报, 2004, 25(1):114-115.2.王鸿、张伟、孟娜. 细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价[J]. 首都医科大学学报, 2011,26 (1):1006-7795.3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas. DOI: 10.5772/515185.辛颜彬.细胞培养污染的发生、预防及清除[J].军事医学科学院院刊，1989，13( 6):468-470.

贴壁细胞因其培养过程较为繁琐，所以培养时更容易出现问题。以下总结了贴壁细胞培养中常见的6种问题，并详细介绍原因和解决方法，若培养时遇到这些情况，可参考对应解决方法处理。（一）传代后细胞全部飘起            解决方法：检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色（如下图），检查瓶盖是否透气，不透气瓶盖是否被拧松。 通常培养基偏碱，颜色就会偏紫，主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫，培养基量太少，或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好完全培养基后分装到50mL离心管并于一周内用完，量少时放到15mL离心管里保存。（二）传代后部分细胞漂浮          原因及解决方法如下         1.传代前细胞密度太大：一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮；         2.细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善；         3.吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生；         4.培养基更换后不适应：更换回原来的培养基；或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期。（三）传代后细胞变形          原因及解决方法         1.变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期；         2.变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态；消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响；培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。（四）细胞生长周期变慢，边养边漂         原因及解决方法如下         细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞密度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期         传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min；频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。（五）传代后细胞成团          解决方法如下         1.低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落；         2.使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率；         3.重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例（增加比例不超过5%）；         4.接种时，减少培养基量（如T25加3mL）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基到正常用量。（六）细胞出现空泡         原因及解决方法如下            1.正常的细胞活动：有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动，无需特殊处理（如Caco-2细胞）；            2.血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良：可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决；         3.机械损伤、PH偏高或偏低等造成细胞受损：注意培养条件及操作手法。

1.CHO细胞是应用于大规模生产治疗性蛋白质和重组蛋白表达的最常见哺乳动物细胞系由哺乳动物细胞产生的蛋白质疗法改变了人类医疗水平的格局。基于哺乳动物细胞的生物过程已用于制造病毒疫苗、诊断和治疗蛋白质。在蛋白质治疗剂的生产中，细胞是产生蛋白质的主要宿主。最广泛使用的宿主哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞和小鼠骨髓瘤细胞。CHO经过长期驯化和改造, 目前已经发展出多个不同的CHO细胞系, 常见的有CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44等。CHO-S细胞也是野生型细胞株, 与CHO-K1都来源于最原始的CHO细胞系。CHO细胞是市场上超过 70% 的蛋白质药物的首选制造宿主细胞，这是因为CHO细胞能够在无血清悬浮培养中以高密度生长，可以在延长的发酵周期中维持高水平的蛋白质表达。除此之外，CHO细胞可以在外源表达的蛋白质上掺入复杂的聚糖，典型的糖蛋白仅包含少数 N-连接聚糖，有助于蛋白质折叠和细胞内运输。当这些聚糖终止于唾液酸残基时，它们会增加对蛋白水解的抵抗力并延长体内血清半衰期。由于这些物理和药代动力学优势，重组糖蛋白表达侧重于最大化每个分子中含有唾液酸的复杂聚糖的数量。因此CHO细胞也成为被广泛用作重组蛋白表达的宿主细胞[2]。2.CHO细胞可以对重组蛋白进行翻译后修饰CHO细胞作为哺乳类的细胞, 与真核表达系统中的酵母细胞、果蝇细胞S9的翻译后修饰相比, 更接近人源细胞蛋白质中的修饰。CHO细胞不仅具有贴壁生长的特点, 还能在无血清无蛋白培养基中进行高密度悬浮培养, 适于大规模的工业化生产。CHO细胞隶属于成纤维细胞, 内源性蛋白分泌少, 可高效分离和纯化重组蛋白。除此之外，CHO细胞具有重组蛋白的高表达和高扩增能力。同时, CHO细胞也有着自身无法避免的遗传缺陷, 即其胞内不含脯氨酸合成基因, 导致无法将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛, 并且在它合成的过程中还需要在对应的培养基中添加辅助生长的L-脯氨酸。

泽叶生物双十一活动进行中双十一活动泽叶生物又来放大招了！谁也不能够阻挡我们一如既往的宠粉!优惠福利真的炒鸡给力听到这个好消息是不是很激动！简单点，省钱的方式简单点！我们不搞那些花里胡哨的我们只要买买买~ 活动时间2022年11月11日-2022年12月31日 活动详情 活动分子生物试剂产品列表货号产品名称价格ZY60185XH植物基因组DNA提取试剂盒¥650ZY61206-B动物基因组DNA提取试剂盒￥450 ZY2087a总RNA提取试剂￥618ZY60001RK植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）￥1152ZY60002RK动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（双柱型）￥1062ZY60189XHDNA凝胶回收试剂盒￥380ZY6007PK高纯度质粒DNA小量提取试剂盒￥380ZY6008PK无内毒素质粒大量提取试剂盒￥998ZY61216核酸清除剂￥500ZY6212F1.1×S4 Fidelity PCR Mix ￥375ZY6213F1.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-)￥375ZY6001PX2×GS Taq PCR Mix￥200ZY6002PX2×GS Taq Master Mix￥200ZY6003PX2×GS Antitaq PCR Mix￥600ZY6312TTriumfi Mouse Tissue Direct PCR Kit￥1299ZY6311STriumfi Plant Direct PCR Kit￥1299ZY6612LUniclone One Step Seamless Cloning Kit￥1280ZY6001SXUnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)￥1890ZY6002SXUnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR￥1500ZY6002QXGS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix￥1200

流式细胞术（Flow cytometry，简称FCM）是一种基于流式细胞仪通过检测偶联荧光信号快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞或者颗粒）的多项特性技术，同时可以对特定群体进行分选。早期流式细胞术主要用于定性，后续慢慢发展为多参数定性、定量以及分选的技术。01流式细胞术的发展流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了首台流式细胞仪。具体发展历程如下[1]：1930年,Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;1936年,Caspersson等引入显微光度术;1940年,Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;1947年,Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;1949年,Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利;1950年,Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;1953年,Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;1954年,Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器; 1959年,B型Coulter计数器问世;1965年,Kamemtsky等提出两个设想:(1）用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos,NM(现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明首台荧光检测细胞计;1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;1975年,Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。02流式细胞术的三大要素1.流式细胞仪:现在市面上有多种型号的流式细胞仪，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。流式细胞仪原理：：在一定的压力下，鞘液带着细胞或者微粒通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射细胞并发生散射和折射，发射出散射光，同时被荧光标记的颗粒发射出荧光。散射光和荧光分别被不同的检测器接收，通过光电倍增管将检测到的荧光信号转换成电信号，这些电信号放大后再经过数据化处理输入电脑，供我们进行分析。液流系统光路系统光路系统即我们常说的激光器，根据其发射激光波长来分，如常见488nm蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，由激光器发出的激光照射到细胞后其产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。这些光信号包括散射光和荧光信号，FSC（散射光信号，用于量化反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，用于量化反应细胞的复杂程度），这些荧光信号来源于细胞上偶联的荧光素，被激光激发后，会发射荧光信号。监测分析系统流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，zui后得出样品群体中细胞的物理化学特征。通道，即光电倍增管，其主要作用为：将光信号转变为电子信号；放大电子信号；分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）以及荧光通道。一个激光器可以有多个荧光通道，一个通道可以对应多个荧光染料。2.样品细胞:流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液。3.荧光偶联抗体︰样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。了解了流式细胞仪的原理，最最重要的是，对不同专业不同背景的我们来说，流式细胞术，到底能干什么呢？01流式细胞术可以用来检测细胞表面以及胞内的各种标志，对细胞进行分群鉴定以及各种蛋白表达量高低的比较。比如CD3是T细胞的标志、CD19是B细胞的标志、EpCAM是上皮细胞的标志等。不仅仅是免疫细胞，其他的如肿瘤细胞、成纤维细胞、干细胞等都可以用流式细胞术进行检测。实体组织只要经过处理后制成单细胞悬液也能用流式细胞术进行分析和分选。02通过标记Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相关基因，流式细胞术可用来检测细胞的增殖以及凋亡。此外还有CFSE、以及PI-annexin V等染料，可用来进行增殖和凋亡分析，在药物对肿瘤影响的研究过程中应用广泛。03流式细胞术可用来分析细胞周期。细胞核DNA含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化，用DNA染料进行染色，DNA含量多，荧光信号强，DNA含量少，荧光强度低。通过对细胞瞬间的快速测定，判断细胞所处的细胞周期时相，并分析群体细胞中处于不同周期时相的细胞比例，以研究细胞的周期，DNA复制和染色体倍性等。在肿瘤学研究中尤其常用，可以此来判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度与患者预后等。04流式细胞术可用于疾病诊断中病原微生物的检测，以及环境中饮用水、湖泊、河流、原油中的微生物和海洋微生物检测等。05流式细胞术还可用于农林畜牧养殖业，如依据DNA含量，用于玉米、向日葵、葡萄等的倍性鉴定，分选X、Y精子以控制家畜性别。当然，除了以上最常见的几个反面，还有很多其他的用法，这里小编就不一一列举出来了，好啦，本期内容，到这里就结束了，如果本期内容对大家有所帮助的话，不要忘了点赞，关注我哦！

做干细胞三系分化实验的小伙伴，想必对油红O染色、茜素红染色和阿利辛兰染色法很熟悉了，今天来介绍另一种细胞实验常用的染色方法，即苏木精——伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法。HE染色基本原理细胞核染色原理苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。细胞浆染色原理细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7一6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。细胞HE染色流程细胞培养的细胞HE染色过程与组织切片的染色过程基本相同，包括样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明、封固和观察等步骤。01样品制备细胞：取细胞密度约为1×105/mL接种于含盖玻片的培养瓶中，放入CO2培养箱中培养一段时间，待细胞基本长成单层，取出长有细胞的盖玻片，用PBS洗3次。02染细胞核a. 固定将盖玻片浸入95%乙醇固定15min，PBS洗2次，每次1min；浸入苏木精染液，染色5~10min。b. 分色自来水浸洗，浸入稀盐酸乙醇溶液进行分色，数秒钟即可；自来水浸洗，浸入淡氨水中，使胞核蓝化3~5min；自来水浸洗。03染细胞质a. 浸入伊红染液，染色5~10min；b. 自来水浸洗；04脱水逐级脱水：经70%、80%、90%乙醇各脱水1次，95%乙醇脱水2次，百分百的乙醇脱水3次，每次1min。04透明二甲苯透明3次，每次1min。04封固在载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。04观察光镜下观察，细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。注意事项细胞1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。2.切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。4．在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。6.zui后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

在ELISA实验中，偶尔会遇到样品浓度挨近试剂盒的灵敏度就容易发生样本OD450值低于空白值的现象，特别是在血清和血浆样本中。这就有可能是基质效应导致的结果。那什么是基质效应呢？# 基质效应 #分析中，基质指的是样本中被分析物以外的组分，基质常常对分析物的分析进程有显着的烦扰，并影响分析成果的准确性，这些影响和烦扰被称为基质效应。仿照物与被测样本在蛋白丰度、复杂性、pH等要素都会存在差异。当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是过错要素，这时应增加重复，进步操作技术。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。   ELISA试剂盒在开发进程中，标准品不能选用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能选用其仿照物。当样本的基质与其仿照物对比，下降抗原抗体的联络，便产生了样本值低于空白值的现象。构成样本值无法计算出数值，或许数值为负。   如今最常用的去掉基质效应的方法是，经过已知分析物浓度的标准样品，一同尽可能坚持样本中的基质不变，建立一个校正曲线。讲到了这里，那我们要如何去判断是否是基质效应呢？当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是实验操作出现问题，这时应增加重复，进步操作技术。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。基质效应的原因错综复杂，有可能是样品中存在的基质导致原抗体的联络结合能力下降，便产生了样本值低于空白值的现象。导致样本值无法计算出数值，或许数值为负。虽然原因复杂，但有方法可以用来评估基质效应。01第一种：线性稀释一般来讲，抗原和捕获抗体、检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变。02  第2种：掺入回收率实验将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。# 如何避免基质效应 #基质效应可以通过产品研发阶段的优化尽可能去消除的。泽叶生物针对ELISA产品研发进行了多种优化。ELISA试剂盒在开发进程中，标准品不选用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能选用其仿照物。我们量身定制的缓冲液系统，这些优化后的缓冲液体系能很好消除基质效应。还有当检测某个分析物时，其他相关因子或类似结构因子如果有非特异性结合，也会导致基质效应，我们也因此做了大量的交叉反应，确保没有明显的交叉反应和干扰。而且我们试剂盒必须通过严格的基质效应测试，全部包括线性稀释和掺入回收率实验，并把测试结果记录在说明书中。#ELISA 操作常见问题及解决办法#在确定 ELISA 试剂盒为真的情况下，应严格按照说明书进行操作，比如使用干净容器和要求的水质配置缓冲液等，主要注意要点如下：移液操作时，酶标板孔中要垂直悬空加入液体，避免加到孔壁上。实验前将所有试剂平衡至室温。标准品粉末溶解前需要先短暂离心，使管内标准品全部集中在管底。实验要做复孔，减少误差。振荡孵育，加强反应。每次洗板必须将洗液弃干净。酶标仪检测前预热，双波长检测。注意显色判断，适时终止。但有时即使完全按照说明书操作，仍然会出现诸多问题，可以按照问题类别逐一进行排查。01标准拟合不佳可能原因解决方法标曲稀释不当按照说明书进行倍比稀释,充分混匀标准品未完全溶解或储存不当充分溶解标准品，涡旋震荡。溶解后放-20储存，避免反复冻融洗涤不充分充分弃去废液,有条件建议用洗板机洗涤孵育过程中板子堆叠保持板子分开移液错误校准移液器曲线拟合方式不合适使用四参数Logistics拟合02标曲正常，样本信号弱可能原因解决方法细胞因子浓度低(当样本浓度接近或低于试剂盒的灵敏度时容易发生样本值低于零孔值的现象)可参考相关文献增加刺激时间或浓度。或使用高灵敏度试剂盒基质效应掩盖。基质效应可由许多基质成分引起,包括:内源性生物成分(如磷脂、碳水化合物和内源性代谢物(胆红素)之间的相互作用或目的因子和基质之间的相互作用，如与血浆蛋白的共价结合)等。这会导致错误的样品读数。将样品稀释2倍或5倍减少基质效应。03标曲正常，样本信号强可能原因解决方法样本浓度过高稀释样本，可做预实验梯度浓度稀释04整体信号弱可能原因解决方法孵育温度过低室温条件温度约25"C孵育不充分室温体系需使用微量振荡器洗板太用力机洗，检测洗涤系统压力正常。手洗，吸取缓冲液时轻柔一些孔干了注意不要让孔变干，孵育使用密封膜酶标仪设置错误检查波长、滤光片、设置等，再读显色孵育时间过短可延长到20min缓冲液不兼容确保为同-试剂盒组分05高背景信号可能原因解决方法洗涤不充分，使用手工洗板常出现将洗涤缓冲液加入孔中洗涤，确保孔区域洗涤充分;确保已在洗涤前弃去了所有残留的溶液板放太久才读数尽量5min内读数试剂配制的容器受污染确保试剂新鲜，并用干净容器配制板子脏板子底部擦干净，在实验过程中尽量不要触碰酶标板底部重复使用封板膜或试剂容器，导致试剂残留，生成非特异性颜色每次孵育换新的封板膜，每步使用不同的试剂容器

在之前的文章中，小编给大家简介了核酸提取的常见方法和原理（历史文章点这里），里面提到了分别是苯酚抽提法、碱裂解法、CTAB裂解法、柱层析法和磁珠吸附法。那么，今天小编就来说说苯酚抽提法。苯酚抽提法非常简单，而且十分常见。特别是在提取基因组DNA时，要去掉许多从细胞裂解液中带来的蛋白，苯酚法十分好用。基本原理苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。苯酚抽提的具体步骤将同体积的苯酚和（DNA+蛋白）混合物溶液混合；苯酚和水溶液不互溶，所以分层，水层在上，苯酚层在下。快速震荡，让两层充分混合；静置让两液层分开，分离水层，在水层中得到的应该是大量的DNA和可能少量的蛋白质。苯酚抽提的优缺点优点有效变性蛋白质抑制了DNase的降解作用缺点能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly (A)RNA不能完全抑制 RNaseDNA提取的注意事项1. 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。2.酚一定要碱平衡，使用平衡饱和酚。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。3.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。4.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。5.异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。6.提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。7.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。8.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。9.要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。10.避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。11.吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。12.在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。13.加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。14.加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA。15.将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。16.在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。17.酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。

前几期我们讲到了，PCR技术、逆转录PCR技术以及qPCR技术，这期我们就来讲讲核酸提取的相关知识，核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中图一：核酸模型图核酸提取类型总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。核酸提取的目的核酸提取的目标纯化后的核酸样品中不应该存在对后续实验有影响的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度DNA提取的目的PCR(polymerase chain reaction)RFLP(限制性片段长度多态性)Southern印迹法RNA提取的目的RT-PCR(反转录PCR)蛋白质水平分析（mRNA）Northern印迹法核酸提取纯化原则和要求01保证核酸一级结构的完整性；02排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）；03核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；04其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；05排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。核酸提取的方法酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用，用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用 乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃慢慢绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。碱裂解法载体是目的基因克隆和表达不可或缺的工具，典型的载体如质粒载体，将目的基因与质粒载体链接，获得重组质粒DNA再转染到细菌体内复制。早在1979 年，研究者成功用碱性裂解液快速提取筛选重组质粒DNA。该方法基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离质粒DNA的目的。细菌悬浮液在pH12.6 的碱性溶液十二烷基硫酸钠（SDS）中，会使细胞壁破裂，蛋白质和染色体DNA 变性，质粒DNA 的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链在拓扑学上是相互缠绕的，彼此不会分离。当pH 恢复到中性时，变性的质粒DNA 分子迅速复性，呈溶解状态，而蛋白质与染色体DNA 不能复性而呈絮状沉淀。通过离心处理可除去染色体DNA 与不稳定的大分子RNA 以及蛋白质-SDS 复合物等，而质粒DNA 保存在溶液中，从而达到分离质粒的目的。CTAB裂解法1980年，科学家们使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。植物和某些革兰氏阴性菌含有大量多糖成分，基因组提取，CTAB 是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。后来科学家们采用SDS-CTAB结合法，利用高浓度盐离子和SDS 除去蛋白和多糖，然后用低浓度盐离子和CTAB 进一步纯化DNA。CTAB 裂解法对产生大量多糖的生物体如植物和某些革兰氏阴性菌的核酸提纯非常有用。柱层析法 前面我们提到的几种核酸的分离纯化都是通过液相介质进行，而柱层析法（包括磁珠）都是基于固相分离技术而产生的。不仅使分离上更加方便、快捷, 固相技术的运用还拓宽了待测物范围,并在检测灵敏度、重现性等方面得到了改善。以离心柱法提DNA为例，首先加入相应的裂解液裂解各种类型的样本细胞；其次用特别的 pH 缓冲液调节柱子pH 改变其表面或官能团，使其成为特殊的化学形式以吸附核酸；再次，用洗涤缓冲液洗涤以除去蛋白质等杂质；最后，用 TE缓冲液或水洗脱柱子上的目的核酸，收集纯化的核酸。柱子中的滤膜通常采用硅基材质，比如玻璃微纤维，二氧化硅粒子等。这里的硅基材质能吸附核酸，主要是缓冲液中阳离子发挥的桥梁作用，Na+能吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐酸性条件下，Na+ 打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，使得二氧化硅与DNA紧密结合，而在低离子强度下，DNA将会从硅基膜被竞争性洗脱下来。磁珠法一般用于自动化提取，生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和栠中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。下面是各种核酸提取方法的对比，大家可以根据需要选择合适的核酸提取方法：

各位！各位！敲黑板了！上期咱们讲到了关于PCR的历史、原理以及不同类型收到的阅读量不尽人意小编委屈哼！小样儿~ 小编才不是那种小家子气的人呢，只有你们等到吃了亏才知道感叹：“曾经有一篇《泽叶-PCR技术，看完这篇，再也不用担心不敢问导师了！》摆在我面前，我没有点进去，直到实验失败才后悔莫及。” 大不了重头再来呗！所以，现在开始，划重点！首先，你要对逆转录这个概念，有一个基本的认知。什么是逆转录PCR逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。它是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。RT-PCR可用于场景分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。               RT-PCR操作步骤#RNA抽提方法：TRlzol法。主要成分：苯酚（具有裂解细胞和变性蛋白的作用）。RNA抽提前准备：试剂耗材准备（注意RNase free）、样品的准备。操作步骤：样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min；4℃低温离心（12 000g×20min）；400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10min；4℃低温离心（12 000g×20min）；75%乙醇冲洗；晾干沉淀，DEPC-treated水溶解。#RNA 质量检测方法：分光光度计测定、凝胶电泳法#反转录是以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中遗传信息的流动方向和转录时相反，所以称为“反转录”。在这个过程中需要一个反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（complementary DNA, cDNA）。这个过程中根据不同的情况选择不同的反转录引物，如果要检测的RNA有poly A尾巴，可以用Oligo(dT)做反转录引物；如果要检测的RNA没有poly A尾巴，就用随机引物（random primer）来反转；如果要检测的RNA序列已知，可用特定引物（specific primer）来反转。# PCR程序三步法：第一步：94℃变性30s；第二步（循环30-35次）：94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（时间按照合成速度和长度来计算）；第三步：72℃终止延伸5-10min。#引物引物设计步骤：找到目的基因的CDs序列（存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计）；用软件设计和评价引物（Oligo软件）；blast引物特异性。要求：引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。# PCR酶可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。# PCR体系按所选的PCR酶说明书来配制。#PCR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。影响逆转录PCR的重要因素不同的mRNA转录成cDNA的效率不同，适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合，因此，在进行不均一mRNA反转录时，下面的参数非常重要。一、逆转录酶二、合成 cDNA的引物三、缓冲液及dNTPs如何提高RT-PCR的特异性一、引物选择cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法：随机引物法、oligo（dT）引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物，合成的cDNA的量会比较大，种类也比较杂。#随机引物法随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性最低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA第一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。# Oligo(dT)法Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。#特异性引物法特异性引物法是特异性最高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。二、提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使两者可以结合。然而，某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性，尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温，以提高cDNA合成的特异性。举个栗子，如果一个基因特异性引物（GSP）的退火温度为55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而， 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。qPCR 原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。那在我们了解了qPCR的原理之后，我们接下来就要了解一下这几个我们在做实时荧光定量PCR的实验时，一定要清楚的知道的几个概念：CT值、扩增曲线、基线、荧光阈值和阈值循环数01Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。02扩增曲线（amplification curve）是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。03基线（baseline）是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。04荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。05阈值循环数表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。06荧光化学目前，实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。那我们要如何选择qPCR的检测方法呢？下面我就列出他们各自的优缺点，大家可以参考一下！ qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量qPCR常见问题分析1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。6. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解

        肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，通常被称为运动神经元疾病，是一种渐进性的致命疾病，影响大脑和脊髓的神经细胞，导致肌肉失去控制，患者变得越来越瘫痪，失去说话、进食和呼吸的能力。        在97%的ALS病例中，一种常见现象是，参与RNA调控的蛋白质(称为RNA结合蛋白)从运动神经元的细胞核异常聚集到周围的细胞质中。        在今天(8月6日)发表在《大脑通讯》(Brain Communications)杂志上的一项新研究中，研究人员使用了实验室中生长的肌萎缩性侧索硬化症患者捐赠的皮肤细胞中的运动神经元，证明有可能逆转三种RNA结合蛋白的错误定位。捐献细胞的患者都有一种叫做VCP的酶突变。这种突变只出现在一小部分ALS病例中        他们发现，当VCP酶发生突变时，这些蛋白质的异常位置就会引起，而VCP酶已经被证明会增加其活性。        重要的是，当研究人员在患病细胞中阻断这种酶的活动时，细胞核和细胞质之间的蛋白质分布就会恢复到正常水平。他们使用的抑制剂与目前正在进行II期癌症试验的药物类似，也可以阻断VCP的活性。        克里克大学人类干细胞和神经变性实验室的作者兼博士后贾斯敏·哈利说:“证明一种化学物质可以逆转肌萎缩性侧索硬化症的一个关键特征是非常令人兴奋的。”“我们证明，这种方法对三种关键的RNA结合蛋白有效，这很重要，因为它表明它也可以用于其他疾病表型。”        “需要更多的研究来进一步调查这一点。我们需要看看这是否可能逆转ALS的其他病理特征，以及其他ALS疾病模型。”        正如同一小组最近在《大脑》杂志上发表的第二项研究中所看到的，试图了解ALS疾病机制的工作正在进行。科学家们研究了内含子保留转录本，这是RNA的一部分，通常是在剪接过程中从基因序列中剪切下来的，在ALS患者中，剪接也从细胞核转移到细胞质。通过分析患病的运动神经元中的RNA，他们在细胞质中发现了超过100种内含子保留转录本。        人类干细胞和神经退行性变实验室的作者和项目研究科学家Giulia Tyzack说:“我们对在ALS患者细胞中发现的不同内含子保留转录本的数量感到非常惊讶，这些转录本从细胞核进入细胞质。我们没想到会观察到这种程度。”        雅各布·尼夫斯是人类干细胞和神经变性实验室的作者和科学家，他补充道:“想象一下这里发生了什么，我们可以考虑去电影院看电影。通常情况下，我们不会在整部电影中看到广告，但如果出了什么问题，这些广告可能会突然出现在奇怪和意想不到的地方。这些保留的内含子有点像这些异常的广告中断。”        科学家们认为细胞质中内含子保留转录本的收集可能是吸引RNA结合蛋白进入细胞质的一个因素，尽管还需要更多的研究来证实这一点。        Rickie Patani，资深作者，克里克人类干细胞和神经退行性变实验室的组长，伦敦大学学院皇后广场神经学研究所的教授，国家神经学和神经外科医院的神经专家顾问，说:“我们的两篇论文共同展示了实验室科学是如何促进我们对这种复杂和毁灭性疾病的理解的，并为未来可能开发出有效的治疗方法提供了一些保证。”        *大约90%的ALS病例是散发性的，10%是家族性的，这意味着该病家族中有病史。VCP突变发生在大约1 - 2%的家族病例中。郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢

首先，你要对逆转录这个概念，有一个基本的认知。什么是逆转录PCR逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。它是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。RT-PCR可用于场景分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。               RT-PCR操作步骤#RNA抽提方法：TRlzol法。主要成分：苯酚（具有裂解细胞和变性蛋白的作用）。RNA抽提前准备：试剂耗材准备（注意RNase free）、样品的准备。操作步骤：样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min；4℃低温离心（12 000g×20min）；400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10min；4℃低温离心（12 000g×20min）；75%乙醇冲洗；晾干沉淀，DEPC-treated水溶解。#RNA 质量检测方法：分光光度计测定、凝胶电泳法#反转录是以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中遗传信息的流动方向和转录时相反，所以称为“反转录”。在这个过程中需要一个反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（complementary DNA, cDNA）。这个过程中根据不同的情况选择不同的反转录引物，如果要检测的RNA有poly A尾巴，可以用Oligo(dT)做反转录引物；如果要检测的RNA没有poly A尾巴，就用随机引物（random primer）来反转；如果要检测的RNA序列已知，可用特定引物（specific primer）来反转。# PCR程序三步法：第一步：94℃变性30s；第二步（循环30-35次）：94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（时间按照合成速度和长度来计算）；第三步：72℃终止延伸5-10min。#引物引物设计步骤：找到目的基因的CDs序列（存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计）；用软件设计和评价引物（Oligo软件）；blast引物特异性。要求：引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm相近以保证其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。# PCR酶可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。# PCR体系按所选的PCR酶说明书来配制。#PCR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。影响逆转录PCR的重要因素不同的mRNA转录成cDNA的效率不同，适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合，因此，在进行不均一mRNA反转录时，下面的参数非常重要。一、逆转录酶二、合成 cDNA的引物三、缓冲液及dNTPs如何提高RT-PCR的特异性一、引物选择cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法：随机引物法、oligo（dT）引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物，合成的cDNA的量会比较大，种类也比较杂。#随机引物法随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性较低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA低一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。# Oligo(dT)法Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。#特异性引物法特异性引物法是特异性较高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。二、提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使两者可以结合。然而，某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性，尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温，以提高cDNA合成的特异性。举个栗子，如果一个基因特异性引物（GSP）的退火温度为55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而， 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。好啦！今天就讲到这里啦！最近出的这两期关于分子生物学的PCR实验希望大家有所收获！小编会继续加油，你的四连“分享”、“收藏”、“点赞”、“在看”，是对小编的最大的支持！咱们下期再会，Skr~