各位!各位!
敲黑板了!
上期咱们讲到了
关于PCR的历史、原理以及不同类型
收到的阅读量不尽人意
小编委屈
哼!小样儿~ 小编才不是那种小家子气的人呢,只有你们等到吃了亏才知道感叹:“曾经有一篇《泽叶-PCR技术,看完这篇,再也不用担心不敢问导师了!》摆在我面前,我没有点进去,直到实验失败才后悔莫及。” 大不了重头再来呗!
所以,现在开始,划重点!
首先,你要对逆转录这个概念,有一个基本的认知。
什么是逆转录PCR
逆转录PCR(reverse transcription PCR)或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。它是一种以 RNA 为样本,RNA链被逆转录成为互补DNA(cDNA),再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。
RT-PCR可用于场景
分析基因的转录产物;
获取目的基因;
合成cDNA探针;
构建RNA高效转录系统。
RT-PCR操作步骤
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RNA抽提
方法:TRlzol法。
主要成分:苯酚(具有裂解细胞和变性蛋白的作用)。
RNA抽提前准备:试剂耗材准备(注意RNase free)、样品的准备。
操作步骤:样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min;4℃低温离心(12 000g×20min);400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10min;4℃低温离心(12 000g×20min);75%乙醇冲洗;晾干沉淀,DEPC-treated水溶解。
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RNA 质量检测
方法:分光光度计测定、凝胶电泳法
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反转录
是以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中遗传信息的流动方向和转录时相反,所以称为“反转录”。在这个过程中需要一个反转录酶,合成的DNA称为与RNA互补的DNA(complementary DNA, cDNA)。这个过程中根据不同的情况选择不同的反转录引物,如果要检测的RNA有poly A尾巴,可以用Oligo(dT)做反转录引物;如果要检测的RNA没有poly A尾巴,就用随机引物(random primer)来反转;如果要检测的RNA序列已知,可用特定引物(specific primer)来反转。
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PCR程序
三步法:
第一步:94℃变性30s;
第二步(循环30-35次):94℃变性30s,55-60℃退火30s,72℃延伸24s(时间按照合成速度和长度来计算);
第三步:72℃终止延伸5-10min。
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引物
引物设计步骤:
找到目的基因的CDs序列(存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计);用软件设计和评价引物(Oligo软件);blast引物特异性。
要求:
引物长度为15-30bp,最常用的为23bp;引物Tm值介于62-73℃之间,上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作;3’-端的Tm值要低于5’端;引物GC含量约为40-60%;避免扩增模板的二级结构域;避免引物的二级结构;避免与靶DNA错配。
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PCR酶
可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。
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PCR体系
按所选的PCR酶说明书来配制。
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PCR产物检测
一般采用琼脂糖凝胶电泳,必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
影响逆转录PCR的重要因素
不同的mRNA转录成cDNA的效率不同,适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合,因此,在进行不均一mRNA反转录时,下面的参数非常重要。
一、逆转录酶
二、合成 cDNA的引物
三、缓冲液及dNTPs
如何提高RT-PCR的特异性
一、引物选择
cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法:随机引物法、oligo(dT)引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物,合成的cDNA的量会比较大,种类也比较杂。
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随机引物法
随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸,其长度通常为6个核苷酸,能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时,可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性最低的。使用此方法时,体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA第一链的模板,合成的cDNA中96%来源于rRNA。
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Oligo(dT)法
Oligo(dT)引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成,能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆,不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%, 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。
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特异性引物法
特异性引物法是特异性最高的一种方法,该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸,用此类引物仅合成所需的cDNA。
二、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使两者可以结合。然而,某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性,尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。
三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶
热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温,以提高cDNA合成的特异性。举个栗子,如果一个基因特异性引物(GSP)的退火温度为55℃,那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录,GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而, 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应,这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。
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