技术干货 | 逆转录PCR技术

三步法：

第一步：94℃变性30s；

第二步（循环30-35次）：94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（时间按照合成速度和长度来计算）；

第三步：72℃终止延伸5-10min。

引物设计步骤：

找到目的基因的CDs序列（存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计）；用软件设计和评价引物（Oligo软件）；blast引物特异性。

要求：

引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm相近以保证其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。

可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。

按所选的PCR酶说明书来配制。

一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性较低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA低一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。

Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。

特异性引物法是特异性较高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。