关注
已关注
已认证
粉丝量 0
400-860-5168转4668
仪器信息网认证电话，请放心拨打
ELISA实验的基质效应及常见问题解析
在ELISA实验中，偶尔会遇到样品浓度挨近试剂盒的灵敏度就容易发生样本OD450值低于空白值的现象，特别是在血清和血浆样本中。这就有可能是基质效应导致的结果。
那什么是基质效应呢？ 分析中，基质指的是样本中被分析物以外的组分，基质常常对分析物的分析进程有显着的烦扰，并影响分析成果的准确性，这些影响和烦扰被称为基质效应。 讲到了这里，那我们要如何去判断是否是基质效应呢？ 当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是实验操作出现问题，这时应增加重复，进步操作技术。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。基质效应的原因错综复杂，有可能是样品中存在的基质导致原抗体的联络结合能力下降，便产生了样本值低于空白值的现象。导致样本值无法计算出数值，或许数值为负。虽然原因复杂，但有方法可以用来评估基质效应。 一般来讲，抗原和捕获抗体、检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变。 将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。 基质效应可以通过产品研发阶段的优化尽可能去消除的。泽叶生物针对ELISA产品研发进行了多种优化。ELISA试剂盒在开发进程中，标准品不选用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能选用其仿照物。我们量身定制的缓冲液系统，这些优化后的缓冲液体系能很好消除基质效应。还有当检测某个分析物时，其他相关因子或类似结构因子如果有非特异性结合，也会导致基质效应，我们也因此做了大量的交叉反应，确保没有明显的交叉反应和干扰。而且我们试剂盒必须通过严格的基质效应测试，全部包括线性稀释和掺入回收率实验，并把测试结果记录在说明书中。 在确定 ELISA 试剂盒为真的情况下，应严格按照说明书进行操作，比如使用干净容器和要求的水质配置缓冲液等，主要注意要点如下： 移液操作时，酶标板孔中要垂直悬空加入液体，避免加到孔壁上。 实验前将所有试剂平衡至室温。 标准品粉末溶解前需要先短暂离心，使管内标准品全部集中在管底。 实验要做复孔，减少误差。 振荡孵育，加强反应。 每次洗板必须将洗液弃干净。 酶标仪检测前预热，双波长检测。 注意显色判断，适时终止。 但有时即使完全按照说明书操作，仍然会出现诸多问题，可以按照问题类别逐一进行排查。 可能原因 解决方法 标曲稀释不当 按照说明书进行倍比稀释,充分混匀 标准品未完全溶解或储存不当 充分溶解标准品，涡旋震荡。溶解后 放-20储存，避免反复冻融 洗涤不充分 充分弃去废液,有条件建议用洗板机洗涤 孵育过程中板子堆叠 保持板子分开 移液错误 校准移液器 曲线拟合方式不合适 使用四参数Logistics拟合 可能原因 解决方法 细胞因子浓度低(当样本浓度接近或低于试剂盒的灵敏度时容易发生样本值低于零孔值的现象) 可参考相关文献增加刺激时间或浓度。或使用高灵敏度试剂盒 基质效应掩盖。基质效应可由许多基质成分引起,包括:内源性生物成分(如磷脂、碳水化合物和内源性代谢物(胆红素)之间的相互作用或目的因子和基质之间的相互作用，如与血浆蛋白的共价结合)等。这会导致错误的样品读数。 将样品稀释2倍或5倍减少基质效应。 可能原因 解决方法 样本浓度过高 稀释样本，可做预实验梯度浓度稀释 可能原因 解决方法 孵育温度过低 室温条件温度约25"C 孵育不充分 室温体系需使用微量振荡器 洗板太用力 机洗，检测洗涤系统压力正常。手洗， 吸取缓冲液时轻柔一些 孔干了 注意不要让孔变干，孵育使用密封膜 酶标仪设置错误 检查波长、滤光片、设置等，再读 显色孵育时间过短 可延长到20min 缓冲液不兼容 确保为同-试剂盒组分 可能原因 解决方法 洗涤不充分，使用手工洗板常出现 将洗涤缓冲液加入孔中洗涤，确保 孔区域洗涤充分;确保已在洗涤前 弃去了所有残留的溶液 板放太久才读数 尽量5min内读数 试剂配制的容器受污染 确保试剂新鲜，并用干净容器配制 板子脏 板子底部擦干净，在实验过程中尽 量不要触碰酶标板底部 重复使用封板膜或试剂容器，导致试剂残留，生成非特异性颜色 每次孵育换新的封板膜，每步使用 不同的试剂容器
仿照物与被测样本在蛋白丰度、复杂性、pH等要素都会存在差异。当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是过错要素，这时应增加重复，进步操作技术。当许多样本都低于空白值时，应思考基质效应的影响，建立校正曲线予以修改。
ELISA试剂盒在开发进程中，标准品不能选用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能选用其仿照物。当样本的基质与其仿照物对比，下降抗原抗体的联络，便产生了样本值低于空白值的现象。构成样本值无法计算出数值，或许数值为负。
如今最常用的去掉基质效应的方法是，经过已知分析物浓度的标准样品，一同尽可能坚持样本中的基质不变，建立一个校正曲线。
更多
免疫组化（IHC）的 "疑难杂症" 再也不愁
厂商
2024.01.26
制备抗体时抗原的选择
厂商
2024.01.26
文献集锦 | 泽叶生物8/9月文献引用分享
厂商
2023.11.24
双十一献礼 | "E" 路 "胞" 到，不容错过
厂商
2023.11.01
