定量肉类掺假检测解决方案

    “挂羊头，卖狗肉”是日常用的一个熟语。虽然随着时间的发 展，这句话已经难以反应最真实的情况，在世界上大部分地 方，狗已经不作为食用肉的来源，即使在极少数食狗肉的地 方，狗肉的价格也往往比羊肉还高，已经失去了造假的意义。 但是，这种商品标识与实际商品的组成不一致的情况，却是长 期存在的。 自从 2013 年欧盟“马肉风波”之后，中国肉类 掺假的现象也屡见报道，进一步加深了人们对肉类真实性的担 忧。这种非标明的添加，极大的扰乱的市场次序，影响相关宗 教人士、特殊风俗与部分肉类禁食人士的情感与健康，也带来 了潜在致病性和疾病控制的难题。目前最常用检测的方法有： 基于核酸的聚合酶链式反应技术（PCR），和基于抗体抗原结 合的酶联免疫法（ELISA）。前者受到 DNA 降解，复杂基质的 干扰和样品提取与扩增方法的影响，干扰了定性和定量的准确 性。后者往往受制于抗体的制备，加工过程中蛋白变性，复杂 基质和近亲缘种属之间同源干扰导致的假阳性的影响 [1, 2]。

（A：样品裂解； B：肉类裂解样品还原烷化酶切；C：高分辨质谱平台采集每 个物种数据；D：Proteome Discoverer 2.0，SEIVE 2.0 软件寻找物种特征性多肽，Pinpoint 软件批量自动生成定量离子对；E：TSQ  Quantiva 定量分析） 随着生物质谱技术的成熟，大规模的定性和定量研究蛋白表达 谱的技术已经很成熟。因此，利用质谱技术寻找不同肉类样 品特征性蛋白或者多肽，并进行定量，能够避免现在最常用的 PCR 技术和 ELISA 所面临的上面的种种问题，其优点包括：不 受食品加工的过程影响，因为氨基酸序列比核酸序列在加工过 程中更容易保存；同时实现定性与定量，避免假阳性且定量结 果更加准确可靠；能够同时监测多种添假 [2]。 猪肉，禽肉，牛肉和羊肉是世界上消耗量最大的四种肉类 [3]。 大多数情况下，羊肉最贵，可能比最便宜的禽肉贵到 5 倍以上， 在实际生活中，对不法商人具有最大的掺假诱惑力。我们基于 超高分辨的 Q Exactive 质谱平台，研究了五种常见肉类彼此之 间的特征性专属多肽。选取其中找到的部分多肽，通过人为的 将几种不同的肉类进行混合研究，模拟现实中掺假的情况，用 TSQ Qµantiva 建立了基于 SRM（Selected Reaction Monitoring） 的掺假比例定量方法。整个实验流程如下（图 1）： AN_C_LCMSMS_7_201506Y表 1. 色谱梯度 实验方法： 1.材料与样品制备 本实验所用肉类样品牛肉，猪肉，鸡肉和鸭肉购自于上海某大 型超市，羊肉购自于上海某羊肉专卖店。五种肉类样品分别去 皮与脂肪取纯肌肉样品约 100 mg，用 RIPA 裂解液裂解后丙酮 沉淀，尿素溶解后取部分测浓度，剩余样品还原烷化，酶切过 夜，固相萃取除盐，离心浓缩后用 0.1%FA 溶解后备用。 2.掺假实验 将鸡与鸭的裂解液等比例混合，取羊 1 µg 总蛋白酶切产物六份， 分别添加鸡和鸭的裂解酶切产物 1 µg、100 ng、10 ng、5 ng、 1 ng、0.1 ng，模拟不同比例的掺假样品，每份样品进样三次。 3.色谱条件 液相 RSLC U3000 ，流速 0.2 mL/min，流动相 A 相为 0.1%  FA/H2O，流动相 B 相为 0.1% FA/ACN。色谱柱 Accucore- 150-C18，100mm*2.1mm。梯度条件为： 实验结果 1.种属特征性多肽的确认 种属特征性多肽寻找验证是肉类掺假实验的关键点，因此我们 通过高分辨的 Q Exactive 质谱平台，研究了常见的五种肉类。 选出每个物种专属性的多肽，去掉含有酶漏切位点的多肽，鉴 定到各个物种相对于其他四种物种专属性的多肽条数为：鸡 339 条，鸭 125 条，猪 426 条，牛 337 条，羊 152 条。其 中，鸡和鸭都为鸟纲家禽类，羊、牛、猪为哺乳纲真兽亚纲动 物，前两者之间的进化亲缘关系更近，我们同时找到了鸡和鸭 相对其他三种兽类专属性的多肽 336 条。Pep003 为来源于鸡/ 鸭的特征性肽段，图 2 为利用 TSQ Quantiva 在不同掺假比例 的样本中定量 Pep003 的 XIC（eXtracted Ion Chromatogram） 图： 4.质谱采集方法 质谱离子源参数设置为：喷雾电压 3500 V，鞘气 38 Arb，辅气 15 Arb，反吹气为 0 Arb，离子传输管温度 275℃，离子源雾化 温度为 380℃。质谱采集参数为：采集周期为 0.3 s， 碰撞气 为 1.5mTorr， Q1 和 Q3 分辨率都为 0.7，源内裂解能量为 0。 Time (min) A相（%） B相（%） 0 100 0 0.2 90 10 16 60 40 17 20 80 17.5 20 80 18.5 100 0 20 100 0 Time(min) 40000 20000 0420 5000 0 200 0 100 0 10 020 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 10:33 10:37 10:36 10:38 10:39 10:40 1000ng 100ng 10ng 5ng 1ng 0.1ng blank 图 2. TSQ Quantiva 在不同掺假比例的样本中定量 Pep003 的 XIC 图 2.定量离子对的选择 依据丰度信息，我们选取了六条鸡与鸭的特征性多肽（不含 漏切位点，不含甲硫氨酸，不含 NXS/T 的糖基化基序），导 入 Pinpoint 软件，利用 Pinpoint 软件自动导出离子对与碰撞 能量信息，先采集一遍样品的信息，利用 Pinpoint 软件生成 schedule 信息，导入仪器自动生成最后的采集方法。方法中的 离子对信息见下表： Intensity表 2. 定量离子对和 Schedule 信息 Compoµnd Retention Time  (min) RT Window  (min) Polarity Precµrsor  (m/z) Prodµct (m/z) Collision  Energy (V) Pep001 8.68 2 Positive 764.9 817.9 29 Pep001 8.68 2 Positive 764.9 919.0 29 Pep001 8.68 2 Positive 764.9 990.1 29 Pep001 8.68 2 Positive 764.9 1089.2 28 Pep001 8.68 2 Positive 764.9 1188.4 27 Pep001 8.68 2 Positive 764.9 1301.5 26 Pep002 10.07 2 Positive 829.9 425.5 32 Pep002 10.07 2 Positive 829.9 912.9 32 Pep002 10.07 2 Positive 829.9 1012.1 31 Pep002 10.07 2 Positive 829.9 1198.3 30 Pep002 10.07 2 Positive 829.9 1297.4 29 Pep003 10.36 2 Positive 997.6 562.6 35 Pep003 10.36 2 Positive 997.6 675.7 35 Pep003 10.36 2 Positive 997.6 1165.2 35 Pep003 10.36 2 Positive 997.6 1264.4 35 Pep003 10.36 2 Positive 997.6 1335.4 34 Pep004 11.01 2 Positive 748.9 432.5 29 Pep004 11.01 2 Positive 748.9 595.7 29 Pep004 11.01 2 Positive 748.9 856.0 29 Pep004 11.01 2 Positive 748.9 1050.2 28 Pep005 13.55 2 Positive 1039.7 475.6 35 Pep005 13.55 2 Positive 1039.7 546.6 35 Pep005 13.55 2 Positive 1039.7 1140.3 35 Pep005 13.55 2 Positive 1039.7 1353.5 35 Pep006 16.92 2 Positive 973.2 404.5 35 Pep006 16.92 2 Positive 973.2 503.6 35 Pep006 16.92 2 Positive 973.2 881.1 35 Pep006 16.92 2 Positive 973.2 994.2 35 Pep006 16.92 2 Positive 973.2 1305.5 35 3.定量结果与定量下限 通过将鸡肉与鸭肉按不同比例掺加到 1 µg 的羊肉中，利用 SRM  的方法，定量研究能够检测到的最低掺比比例，并利用 Xcalibur  定量模块对上面的多肽分别进行定量，确定线性范围。其中 Pep001 和 Pep003 都能够定量到 5 ng 的最低掺假，剩下的四 条能够定量到 10 ng 掺假。即分别能够检测到 0.5% 比例的掺假 和 1% 比例掺假，实际标准曲线与线性范围如下： Pep001 Pep002 20000 15000 10000 5000 0 8000 6000 4000 2000 0 30000 20000 10000 0 50000 40000 30000 20000 10000 0 10000 8000 6000 4000 2000 0 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100  0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 线性范围：5ng-1000ng Y=-25.0053+52.7902*x Rˆ2=0.9963 W=1/X 线性范围：10ng-1000ng Y=231.214+35.25*X Rˆ2=0.9983 W=Equal 线性范围：10ng-1000ng Y=-36.2485+7.38705*X Rˆ2=0.9999 W:Equal Pep003 Pep004 线性范围：5ng-1000ng Y=-278.354+208.536*X Rˆ2=0.9992 W:Equal Pep005 Pep006 线性范围：10ng-1000ng Y=-11.0538+2.89643*X Rˆ2=0.9999 W:Equal 线性范围：10ng-1000ng Y=-16.9483+9.72766*X Rˆ2=1.0000 W:Equal 图 3. 定量标准曲线与线性范围 Area Area Area Area Area Area4.利用 QED 进行定性确证 QED（Qualitative Enhanced Data）扫描功能是指通过监测 SRM  实时采集信号，利用二级子离子强度触发，采集对应母离子二 级碎裂全扫描谱图，在定量的同时，获得更确切的定性信息的 功能。通过 QED 技术，我们采集了 Pep003 的 QED 质谱图， 图 4 为理论多肽 Pep003 实际谱图与理论 b、y 离子匹配结果： 图 4. Pep003 的 QED 全扫描子离子图 m/z(Da) 200 400 600 800 1000 1200 1400 100 80 60 40 20 0 y1 175.6 730.4 y7 790.8 y8 938.4 y6 1037.8 y11 1165.9 y13 y 1335.7 16 2+ 811.7 y5 562.4 y8 2+ 469.2 讨论 1.监测的专属性多肽的数目 在发现性研究中，文献中报导的 6 条猪专属性多肽 [4-6]，我们只 找到了其中的一条，还有两条是单氨基酸突变，另外三条没有找 到；文献中报导的 21 条鸡专属性多肽我们找到了 17 条 [6, 7]， 其中有一条文献报道有乙酰化修饰，而我们检索过程没有加这个 修饰。现代家猪由野猪驯化而来，经过了约 9000 年的长期的驯 化与饲养过程中，亚种间和亚种内核型都发生了很大的差异，不 同的地域或者品系的猪在蛋白表达上都有极大的差异 [8]；而单氨 基酸多态性（Single amino acid polymorphism，SAP）是自然界普 遍存在的现象，地域和个体差异都能造成这种结果。基于上面的 这些信息，由于动物基因型的差别，以及样品处理过程带来的影 响，每一个物种仅选择一条多肽进行定量，很有可能造成大面积 的假阴性的检出结果，有必要提高每个物种监测的多肽的数目， 降低假阴性的概率。 2.可以利用一些亲缘关系相近的物种之间共有的多肽， 实现同时筛选的目的 鸡与鸭作为常见的肉食性禽类，相对其他三种肉类来说，亲缘 关系要更近一些，而且我们确实发现，它们共有的特异性多 肽的条数（336条）甚至大于我们找到的鸭特异性多肽的条数 （125条）。通过这种方式，还能够部分的弥补很多物种蛋白 数据库不完善的情况（鸭的蛋白数据库就不全）。同时，鸡鸭 同时共有而又相对兽类特异的多肽，往往也增加了其他禽类共 有的可能性，一定程度上更经济的部分实现一些未知禽类物种 添加的可能性。 结论 我们基于赛默飞全方位的质谱解决方案，建立了从掺假的发 现，到定量多肽的选择，以及定量的实现的完整流程，并对 发现的部分多肽进行了掺假实验与定量能力考察。基于实验 结果，对于每一个物种，我们应该同时监测尽可能多的多肽， 尽量避免假阴性的结果。我们同时选取鸡和鸭的六条特征性多 肽，同时对两种禽类肉掺假进行了监测，并确定了最低的掺假 监测限为 0.5%。考虑到掺假比例的经济性与可操作性，远远超 过了实际监测的需求。 与传统的基于 PCR 和抗体的检测方法相比，质谱具有大致相当的 灵敏度，但是拥有更好的避免假阴性与假阳性的结果的能力，且 能够避免由于加工所带来的 PCR 或者抗体相关的空间结构破坏所 带来的影响。 与上述掺假相比，还有一种相对来说，更为严重，性质更恶劣 的掺假——病死肉的掺假。基于上述的思路，我们认为，通过 进一步系统的研究，质谱也能够成为一种监测病死肉的手段， 斩断病死肉流入餐桌的魔爪，与我们全方位的农残筛查与检测 手段一起，为食品安全提供全方位的保障。同时，利用这种研 究方法，我们还能助力有机肉类产品生产商，提供从肉类良种 选择依据到肉类质量标准建立的可能性。