好文推荐 | 水杨酸片在流池法溶出仪性能验证试验中的应用

翻译：华溶应用中心

审核：工业药剂发烧友

摘要

流池法溶出仪是控释剂型、难溶性药物和许多特殊剂型(如混悬液、软胶囊、植入剂、微球和脂质体)溶出度测试的首选仪器。虽然流池法溶出仪已列入药典多年，但一直没有正式的性能验证试验(PVT)方法。在这项研究中，水杨酸片被用来开发流池法的PVT。水杨酸片在篮法和桨法装置上相同的溶蚀和零级释放机制，可作为流池法装置中PVT的潜在参考标准品。在第一阶段，采用实验设计法(DoE)系统考察了四个参数对水杨酸片溶出度的影响。片剂装载方式是影响溶出度的最重要参数；流速和池体内径(ID)也有显著影响，温度对溶出的影响可以忽略不计。在第二阶段，由四名不同的分析人员在不同的流池法装置上（即四名合作者）进行溶出试验，以进行重复性和重现性评估，并确定PVT的初步可接收标准。第二阶段的实验条件是将片剂放置在带有玻璃珠的片剂支架上，池体ID为12 mm，流速为16 mL/min，温度为37℃，90分钟采集样品。第五个合作者的数据证实了PVT的可重复性。

关键词

一、引言

流通池是一种使用流动的溶出介质通过装有制剂的池体的溶出装置（推荐使用华溶DS-7CP PLUS 流池法溶出系统）。流通池装置由放置的介质贮液池、泵、水浴、流通池、过滤系统和样品收集器组成。制剂与介质贮液池分离，便于在溶出试验中调节介质体积或pH值。流通池装置具有闭环和开环两种结构。在闭环系统下，介质体积可以根据储液容量进行很好的改变。该配置特别适用于低剂量药物的溶出试验，通过使用少量介质达到足够的浓度。开环系统提供了无限的漏槽条件，这通常是控释剂型和难溶性药物的首选条件。在开环系统中，流通池可以在实验过程中改变溶出介质，模拟体内环境相关的pH变化。这特别适用于pH敏感型药物的溶出测试，如靶向剂型和靶向药物释放系统。配备各种类型的流通池，流池法装置在新型和特殊剂型的溶出试验中也显示出很大的优势，包括但不限于脂质体、纳米颗粒、微球、粉末、颗粒、混悬液、软胶囊、植入物、栓剂、油类制剂和凝胶。

从历史上看，流池法溶出仪最早于20世纪60年代在美国应用于溶出度试验，随后被引入许多国家和国际组织。在中国，与流池法类似的设备于1985年首次列入中国药典，但于1990年被撤回；2020年，流池法溶出仪被正式纳入《中国药典》。随着流池法溶出仪在中国的普及，需要一个标准的性能验证试验（PVT）来保证溶出度试验的质量。一般来说，需要机械校准和PVT来确定溶出装置的适用性。PVT是一种评估整个程序的方法，包括仪器、分析程序和分析人员。PVT的开发涉及到几个因素，例如在短时间内执行测试的便利性和准确性（即重复性、稳健性和重现性）。此外，参考标准药物应该是稳定的，最好是无毒的产品，具有易于量化分析的特点。最后，PVT的结果应响应设备的关键操作参数的变化。Eaton及其同事报道了用于流池法PVT的早期开发，将水杨酸片作为候选参考标准片，其中研究了流速、温度、玻璃珠的数量和大小、脱气水平、片剂方向、仪器制造商和分析人员。然而，从政策的角度来看，世界上还没有广泛接受的机械检验准则和PVT标准。

目前的研究范围是开发用于流池法装置的PVT，其中将评估影响溶出的主要变量并确定PVT的初步接受标准。水杨酸片剂具有不崩解、无毒、性能稳定性好等特点，有望成为理想的试验药物，Eaton等人已成功将其用于PVT的开发。更重要的是，目前中国的篮法、桨法和小杯法PVT均采用水杨酸片，保证了片剂的质量，也为未来的流池法的PVT提供了良好的依从性。

研究分为两个阶段：第一阶段采用实验设计(DoE)方法，系统考察各参数对水杨酸溶出度的影响，一个有力统计工具，用于确定过程中各因素和响应之间的相关性。在第二阶段，参考美国药典（USP）1法和2法的PVT分析方法，将由不同的分析人员在不同仪器上进行重复性和重现性评估，获得并应用流动池（4法）PVT的初步验收标准。

二、方法

2.1 材料

使用的材料和试剂如下：水杨酸标准品（99.8%，批号100106202106，中国食品药品监检定研究院），水杨酸标准片（见表1，批号100103-202114，中国食品药品监检定研究院），磷酸二氢钾（99.5%，批号68887172，中国迈瑞尔），氢氧化钠（98%，批号78687053，中国迈瑞尔），超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm, 25°C），玻璃纤维过滤膜GF/F（直径25mm，批号9817071，GE医疗生命科学Whatman，中国制造）。对片剂的理化性质进行了评估，结果见表1。

表1. 水杨酸片的理化特性

2.2 溶出介质和标准溶液

称取47.6克磷酸二氢钾和11.06克氢氧化钠溶于7升超纯水中。调节溶液的pH值在7.4±0.05范围内. 用磁力搅拌器搅拌加热至45℃，用真空泵脱气5分钟（压力低于100毫巴）。

制备水杨酸对照品储备液，称取20mg的水杨酸标准品至250ml容量瓶中。用约1ml乙醇溶解水杨酸粉末，用溶出介质定容至250ml。

制备水杨酸对照品溶液，移取10 mL储备液液至50 mL容量瓶中，溶出介质定容至50ml。

2.3 溶出度试验第一阶段：影响溶出度的变量研究

第一阶段的目标是：

1）研究主要变量对溶出度结果的潜在影响；

2）为第二阶段的重现性和重复性评估确定合适的实验条件。

通过初步实验(数据未显示)，初步确定了4个参数作为自变量：池体内径(ID)、流速、温度、装片方式。其他变量包括介质成分、体积、脱气方法、流通池的配置、玻璃珠加入量和泵脉冲，在本研究中未进行调查。 

采用DoE方法系统地研究了四个选定变量在溶出度检测中的贡献。采用JMP 13软件（SAS Institute Inc.， USA）进行DoE和数据分析（残差最大似然[REML]法）。以水杨酸的溶出度为因变量，进行定制设计。对于四个自变量，将池体ID设置为两个水平（12和22.6 mm）的分类变量；流速设为离散变量，分别为8、16、32 mL/min三个水平；温度设为连续变量，分别为3个水平（35、37、39℃），装片方式设为分类变量，分别为4个水平（片剂在片剂架上且锥体处含玻璃珠[HWB]、片剂在片剂架上锥体处无玻璃珠[HWOB]、片剂在玻璃珠床层顶部[T]、片剂内埋在玻璃珠中[E]）。考虑到参数调整的难度，将装片模式设置为简单，而其他的设置都是困难的。个体变量的主要效应和二次交互效应分析了各变量组合与因变量的相关性。DoE矩阵由33个试验组成，分布在11个区块（补充材料，表S1）。每次试验均参照该矩阵设置合适的仪器参数。 

溶出测试在Sotax CE 7smart系统（固件2.40）上进行，该系统与CP7-35活塞泵和C615组分收集器（Sotax AG，瑞士）相结合。在测试之前，将泵的流量验证到规定值（基于初步实验使用的流量）。所有七个通道的流量最大偏差应小于2%，以满足验证标准。

图1：片剂在片剂架上且锥体处含玻璃珠[HWB]、片剂在片剂架上锥体处无玻璃珠[HWOB]、片剂在玻璃珠床层顶部[T]、片剂内埋在玻璃珠中[E]

图1展示了四种片剂装载方式。对于HWB模式，详细操作如下。将一颗红宝石和一勺玻璃珠（直径1mm）依次放入池体中，然后将一片药片放在药片支架上，然后将GF/F过滤膜组装在池体顶部。HWOB模式与HWB相同，只是没有玻璃珠。T模式也很像HWB，除了把片剂放在玻璃珠床层上而不是放在片剂支架上。对于E模式，首先将药片放在一勺玻璃珠床层顶部，然后在池体的剩余空间中填充玻璃珠。溶出试验的其他参数保持相同，包括7个通道，每个通道900 mL溶出介质，闭环配置，泵脉冲120 r/min，在10、30、60、90和120分钟收集2.5 mL样品溶液。

2.4 溶出度试验第二阶段：重复性和再现性评估

第二阶段的目的是：1）评价水杨酸片作为流池法PVT标准片的可行性；2）考察溶出度试验的重复性和重现性；3）确定PVT的初步验收标准。溶出试验在两个试验装置中进行。在第二阶段测试中四名分析人员和五个组件（Sotax CE 7智能系统，制造年份从2013年到2021年不等）。一个分析人员和一个组装人员的组合被称为合作者。通过这种方式，来自同一合作者的数据由同一程序集中的同一分析人员获得。总共有五个合作者。来自四位合作者的数据被用来确定PVT的初步接受标准，第五位合作者根据该接受标准进行PVT。所有实验在相同的条件下进行，如第一阶段所确定的：12 mm池体ID，16 mL/min流速，37℃， HWB片剂装载模式，7通道，每通道900 mL介质，闭环配置，泵脉冲120 r/min，在10、30、60、90和120分钟收集2.5 mL样品溶液。

在本研究中，建立了流池法装置PVT的单阶和两阶试验的初步可接受范围。分析方法与USP 1法和2法的PVT相似。评估了三个方差成分：合作者间、实验间和残差（实验内）。绘制水杨酸片剂溶出百分数的总体分布规律（补充资料，图S1）。数据分布尾部不均匀，与1法和2法的结果相似。因此，采用自然对数尺度来改善溶出度值分布（转换为正态分布）的对称性。

对于单阶试验，初步接受限由溶解百分比值（对数值）的平均值±t SD确定，其中t为95%置信度系数，SD为可重复性标准差。以7通道装配（Sotax CE 7smart系统）为例，将测试两组7片（共14片），初步验收限值为：

在Eq. 1中，exp代表指数，其中均值和方差(S²)通过重复性和重现性评估估计。下标C、E和R分别表示合作者间、实验间和剩余方差成分。在本研究中，t = 2.776，在均值的SD中有4个自由度。对于对数尺度的实验内方差，其上限为F× ，其中F1为F分布的5%上限。在本研究中，F = 1.933，七通道的分子自由度为12，实验内分母自由度为55。原始百分比溶出度的变异系数（%CV）用对数正态公式对自然对数标度的方差进行变换得到的：

采用单阶试验，需进行2次试验，14片（7片/次× 2次）的数据根据单阶试验的初步验收限度进行评价。

对于双阶实验，有两个初步验收限制，每个阶段一个。阶段1的评估类似于单级检验，使用80%的置信度而不是95%的置信度，这将缩小区间。第一阶段测试更严格的初步验收限制将确保评估PVT中首次运行数据的统计能力。在双阶实验的第二阶段，确定初步验收限制以保持单阶段测试通过的概率(95%置信度)。因此，将第1阶段和第2阶段获得的数据结合起来进行评估，得到第2阶段的初步验收限度，其值应与单阶试验的值相同。

2.5 检测

采用紫外-可见光谱法测定介质中水杨酸的浓度，使用两台紫外-可见光谱仪:UV/VIS Excellence UV7 （Mettler-Toledo GmbH，瑞士），软件版本为3.0.1；Cary 3500 UV-VIS Engine （Agilent Technologies，马来西亚制造），软件版本为Cary UV Workstation版本1.1.298。每个样品（2.5 mL）用空白溶液稀释5倍至12.5 mL，使用石英比色皿（10mm光程）在296 nm处测定吸光度。

三、讨论与结果

以水杨酸片为标准片的可行性分析

水杨酸片的溶出机制为不崩解和溶蚀，用篮桨法溶出仪进行溶出试验证实了这一点。在本研究中，收集了5个时间点（10、30、60、90和120 min）的组分，并采用分光光度法测定其API浓度。以时间为自变量，对溶出度数据进行线性回归分析。所有33项试验均达到极好的线性；31个试验的相关系数为0.9911-0.9999，另外2个试验的相关系数为0.9742和0.9878。说明水杨酸片在流池法装置中的溶出过程为零级释放机制，与在篮法和桨法装置中的一致。尽管在不同条件下进行了33次试验，但该机制不受流经池体参数调整的影响。因此，水杨酸片具有足够稳定的理化性质，可作为流池法溶出仪中PVT的参考标准片。

通过计算RSD分析33个试验溶出度数据的波动。对于五个时间点，RSD结果令人满意，中位数和第三四分位数RSD值分别为2.7%和4.9%。仅观察到少数高RSD值，这可能是由于第一阶段筛选参数未优化以及平行实验数量较少（n = 2）造成的。但90 min时RSD值均小于10%，相对稳定。考虑到PVT方法的效率，选择90 min作为后续分析的关键时间点。这些数据见补充资料(表S2-S4)。

表2. 个体变量的初始效应和二次交互效应

表2显示了四个单独参数的影响及其相互作用。三个参数及其配对相互作用表现出显著差异(p < 0.01)。片剂装载方式是影响溶出度的最重要参数。流速和池体ID也有显著影响。然而，温度对溶解的影响可以忽略不计。

图3. 用数学模型预测了四个参数对水杨酸片溶出度的影响。片剂装载方式HWB为片剂在片剂架上且锥体处含玻璃珠、HWOB为片剂在片剂架上锥体处无玻璃珠、T为片剂在玻璃珠床层顶部、E为片剂内埋在玻璃珠中[E]

图3显示了这四个参数的详细趋势。E型溶出度最高，T型溶出度居中，HWB型和HWOB型溶出度最低（相近），流速与溶出值成正比关系。对于池体ID，12mm的溶出值始终高于22.6 mm。这三种趋势可归因于水杨酸在流池法装置中的零级释放机制。在不崩解的情况下，水杨酸片的溶蚀速度与体积流速成正比。在相同流速下，内径和截面积越小的池体线速度越高，对片剂的侵蚀效应越大。同样，充满玻璃珠的空间有更小的横截面积可供流动通过，这导致了更高的线速度。在E型和T型模式中，放置片剂的空间分别全部和部分填充了玻璃珠。对于HWB和HWOB模式（分别有或没有玻璃珠），放置药片的空间没有填充任何玻璃珠。因此，线速度依次为E、T、HWB/ HWOB，与其溶出速度变化趋势相同。

在第二阶段，我们选择了一个具有适当的溶出值和较小的实验内方差的实验条件进行重复性和重现性评估，以确定流池法装置PVT的初步验收标准。与其他装模式相比，HWB模式的实验内方差（数据未显示）最小。为了保持流池法装置的溶出值与篮法和桨法装置的溶出值相当，选择了12 mm ID池体和16 mL/ min流速的组合。因此，确定第二阶段实验条件：以HWB型放置片剂，流速为16ml /min，流速为12mm，温度为37℃，90分钟取样。该实验条件未纳入33项初步试验，其性能根据JMP软件建立的上述数学模型进行计算和预测。该条件下的溶出度估算值为22.2%，与中国药典中水杨酸PVT片的篮法 （21-26%）和桨法（20-26%）装置的验收标准相似。将该估计值与实验测量值进行了比较，验证了数学模型的拟合性。

对于重复性和重现性评估，表3列出了对应于Eq. 1中参数的溶出度的平均值和方差。流池法的PVT的初步验收标准由式1计算，见表4，包括单阶和双阶测试。数学模型的预测值为22.2%，在初步可接受标准范围内。预测值22.2%与实验平均值24.5%的绝对误差仅为2.3%，表明DoE生成的数学模型是指导和预测实验的有力工具。

第五个合作者的数据证实了成功的重复性。第一次试验的平均溶出值和%CV分别为23.8%和1.5%。这些数据满足初步验收标准（表4），因此不需要进行第二次实验。

表3. 重复性和再现性评估中的溶解值和方差

表4. 流池法（7通道）PVT初步验收标准

未来的合作研究应该有更大的覆盖范围，包括来自监管机构、制药公司、CRO和仪器制造商的实验室。考虑到差异，ISO指南21748规定了参与协作研究的实验室的最少数量为15个自由度。

四、结论

在本次双阶实验研究中，水杨酸片被用于开发流池法装置的PVT，它遵循与篮法和桨法装置相同的溶蚀和零级释放机制。因此，水杨酸片可作为流池法溶出仪PVT的潜在标准参比片。本研究第一阶段发现，影响溶出度的最重要因素是片剂的装载方式，其次是流速和细胞内径；然而，温度没有显著的影响。第2阶段通过以下实验条件（基于第1阶段实验）确定了流池法PVT的初步验收标准：将片剂放置在带有玻璃珠的片剂架上，池体ID为12 mm，流速为16 mL/min， 37℃下90分钟。重复性和重现性评估由不同的分析人员在两个测试设施的不同设备上进行了确认。本研究建立了一个流池法溶出装置的初步的可接受限度溶出PVT。水杨酸片对流池法装置操作参数的敏感性需要在较窄的范围内和更多的合作者进行进一步的研究。

五、参考文献

略