好文推荐 | 奈帕芬胺眼用混悬液的体外释放试验方法

翻译：华溶应用中心
审核：工业药剂发烧友

摘 要

体外释放试验(IVRT)方法对于监测制药生产过程中批次间的质量变化以及表现仿制药与原研药的药物等效性非常重要。为了满足批准眼用混悬液仿制药的监管要求，需要进行体外释放研究。目前尚无药典或非药典方法用于奈帕芬胺眼用混悬液的体外释放研究。
目前的研究旨在筛选使用不同的常规和非常规的各种方法，以建立最合适的奈帕芬胺眼用混悬液的技术，然后优化方法参数并进行验证。试验使用带透析袋的桨法装置（USP 2型）、流通池装置（USP 4型）、水浴转瓶装置和Franz扩散池装置。使用USP 4型装置，在pH 7.4的模拟泪液（STF）中，药物在120分钟内的释放度约为83%，添加表面活性剂月桂醇硫酸酯钠（SLS）后，释放度增加到约97%。使用USP 2型和Franz扩散池装置，药物释放缓慢或未接近完全释放。然而，在水浴转瓶装置的情况下，观察到了突释曲线。药物释放量的估计是通过HPLC方法进行的，所有方法验证参数，如专属性、准确度、线性和精密度都在可接受标准范围内。

一、简介
如果溶出度是药物吸收过程中缓慢且限速的步骤，那么溶出度实验就尤为重要。溶出度实验主要用于确认产品质量和预测批次间的一致性。溶出度试验的原理是在均匀搅拌下测试嵌入颗粒中的药物的释放情况，这通常是将介质通过样品或通过在介质中旋转样品来实现的。美国药典和其他药典试验包含几种不同的溶出装置，用于研究速释口服，缓释口服和非口服剂型。各种常规和非常规的溶出装置可用于研究复杂剂型的溶出曲线，包括注射和眼用混悬液。第一类是药典溶出装置，包括篮法（USP 1型）、桨法（USP 2型）、往复筒法（USP 3型）、流池法（USP 4型）、桨碟法（USP 5型）、转筒法（USP 6型）、往复架法（USP 7型）。此外，其他药典装置，如Franz扩散池和浸没池，特别推荐用于半固体制剂，也可用于复杂混悬液的IVRT。第二类是非药典IVRT装置，包括带透析袋的USP 2型、摇瓶法和水浴转瓶装置。
奈帕芬胺是一种黄色结晶粉末，前药化学设计为2-氨基-3-苯甲酰基苯乙酰胺，分子式为C15H14N2O2，分子结构如图1所示。奈帕芬胺是一种非甾体抗炎药，以眼用混悬剂的形式用于治疗尤其是与白内障手术相关的疼痛和炎症。一旦奈帕芬胺穿透角膜，它就会被迅速生物活化为氨芬酸。此外，氨芬酸通过均匀地抑制COX-1和COX-2受体来显示其活性。奈帕芬胺混悬液作为无菌眼科产品，以浓度为1 mg/mL的混悬液上市。

图1. 奈帕芬胺的分子结构，即2-氨基-3-苯甲酰基苯乙酰胺

Bao等人报道了USP 4型装置、USP 2型装置和Franz扩散池法用于眼用软膏的体外药物释放试验。带有透析袋、浸没池或自制装置的USP 2型装置和带有半固体适配器的USP 4型装置已用于长效注射混悬液的体外释放试验。Veiga等人对用于治疗眼部炎症的基于奈帕芬胺的环糊精纳米聚集体制剂进行了体外和离体评价。由美国食品药品监督管理局（USFDA）发布和管理的溶出度数据库不包括任何用于确定奈帕芬胺眼用混悬液药物释放的药典或非药典方法，它指出“开发一种表征体外释放的方法”。表1总结了迄今为止用于各种眼科制剂体外释放研究的装置。

表1 眼用混悬液及眼膏的仪器一览表

由于结膜囊在不眨眼的情况下容量较小（约30 微升），为眼用混悬制剂的体外药物释放研究选择合适的溶出装置模拟临床使用条件是一项重大挑战。此外，由于防御机制，泪液的稀释和活性成分在吸收部位滞留时间短，会导致用药部位药物浓度降低。
在本研究中，通过高效液相色谱法，使用各种药典和非药典装置，如流通池装置（USP 4型）、水浴转瓶装置和Franz扩散池装置，来判断奈帕芬胺从其眼用混悬液中的释放。为了进行比较，还考虑了使用大体积介质的装置，如带有透析袋的桨法装置（USP 2型）。此外，还对奈帕芬胺眼用混悬液在模拟泪液中的分析方法（HPLC）和优化的溶出技术进行了验证。

二、材料与方法
2.1 材料
市售1mg/ml奈帕芬胺滴眼液（NEVANECTM，由Alcon制造）。以PharmaCupboard公司生产的奈帕芬胺API（纯度99.0%）为标准品。常用试剂氯化钠（NaCl，AR级，Rankem）、碳酸氢钠（NaHCO3，AR级、Finar（Extrapure，Finar）氯化钙二水合物（CaCl2·2H2O，AR级，Finar）、氯化钙（CaCl2，AR级、Rankem）、甲酸铵（（Extrapure，Finar）和盐酸（Extrapure-Merck）用于本研究。月桂醇硫酸酯钠（SLS）（Emparta，Merck）也用作介质中的表面活性剂，以加速药物的释放。所有化学品和常用试剂均为市售，并且在没有进一步纯化的情况下使用。

2.2 模拟泪液的制备
需要使用模拟泪液（STF）来测试眼用混悬液的药物释放曲线，以模拟给药部位的微环境。它是通过将0.67g氯化钠、0.2g碳酸氢钠和0.008g二水合氯化钙溶解在100mL纯化水中制备的。使用稀盐酸将STF的pH调节至7.4。

SLS是溶出研究中非常常见的表面活性剂。在本研究中，选择0.75%浓度的SLS作为最佳浓度。我们已经在有和没有SLS的情况下进行了溶解度测试，并观察到没有SLS就无法实现漏槽条件。因此，为了在介质中完全释放，需要加入SLS。

2.3 实验方法
本研究中使用的装置为含有UV检测器HPLC (Agilent 1260)、含有透析袋1000KD（Spectra/Por）的USP 2型桨法装置（推荐使用华溶DS-1406 AT 全自动取样溶出系统）、含有USP4型活塞泵流通池装置（推荐使用华溶DS-7CP PLUS 流池法溶出系统）、水浴转瓶装置（Varco VRB Wu）和Franz扩散池装置（推荐使用华溶TD-12AT PLUS 透皮扩散系统）。用高效液相色谱法和紫外检测器对溶出样品中的奈帕芬胺进行估算。我们将测试时间限制在2小时以内，因为样品在使用后相对会更快地在眼内释放，因此不希望测试时间持续很长。对于USP 4型和水浴转瓶装置，由于手动取样的实验限制，起始时间点为5分钟。然而，对于Franz扩散和USP 2型装置，选择的最短时间点为15分钟，因为溶解的药物必须穿过作为屏障的膜。

溶出体积的选择和重要。虽然，由于非常低的剂量（一滴; 约30微升）给药至眼内液体量也非常低的眼睛，眼部给药的体积非常低是可取的。我们尝试去根据每种装置的最小体积要求，将介质体积保持在尽可能低的水平。如果我们比较每个装置试验的药物浓度，它都低于生物相关条件，这使得药物释放是一个连续的过程而不受溶解度限制。

2.3.1 奈帕芬胺的高效液相色谱分析
2014年，Usman等人报道了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对眼用混悬液中奈帕芬胺的定量分析。2015年，Rajput等人报道了用反相高效液相色谱法测定原料药和眼用制剂中奈帕芬胺的含量。最近，Padhye等人采用了高效薄层色谱法(HPTLC)方法评价眼用混悬液中奈帕芬胺的含量。在本研究中，使用高效液相色谱法测定了奈帕芬胺在溶出介质中的释放度。流动相为乙腈:10 mM甲酸铵缓冲液(甲酸调至pH 4.0):甲醇(27.5:45:27.5)混合液。流速保持1.0 mL/min。ƛmax在238 nm处被检测到，因为奈帕芬胺在238 nm处有强吸收，在378 nm处有弱吸收。样品分离采用C8色谱柱(Agilent, eclipse 150×4.6 mm, 3.5 μm)，柱箱温度为30°C，进样量为20uL。使用Empower软件3.6 (WatersTM)对色谱进行处理。优化并验证了高效液相色谱分析的条件。

2.3.2 带透析袋的USP 2型装置
USP 2型装置配备1000 mL溶杯，与透析袋一起用于奈帕芬胺眼用混悬液的体外释放试验。由于不溶性悬浮液颗粒中释放药物的分离问题，直接用桨法是不合适的，因此选择USP-2桨法装置的透析膜法用于该制剂。切开截留分子量(MWCO)为1000 KD (Spectra/Por) 的透析袋，用水冲洗2 - 3分钟。用显微镜法测定眼用混悬液中奈帕芬胺有效成分（API）的平均粒径(Primostar 1, Make Zeiss)。奈帕芬胺混悬液的平均粒径分布(PSD)为(2.05±0.25)μm。虽然孔径大小和膜的MWCO之间没有直接关系，但是根据Kovacs等的报道，超过1000 KD的膜的孔径被假定在2 nm以内，这与奈帕芬胺混悬颗粒的PSD相比是非常小的。此外，奈帕芬胺的分子量为254.25道尔顿(0.254 KD)，远小于1000 KD膜。因此，溶解后的API很容易穿过透析袋，而固体API颗粒比1000 KD膜的孔径大得多，所以它不能穿过膜。

将膜袋的一侧折叠并夹紧。然后用移液管转移1 ml眼用混悬液，夹在另一端密封膜。将透析袋分别放入500 ml不含SLS、SLS浓度为0.75% w/v的STF的溶出装置中。桨转速为100 rpm，温度为35±0.5°C。样品(0.1 ml)在15、30、45、60、90和120 min的设定时间间隔内取样，并在“奈帕芬胺的HPLC分析”一节中讨论的条件下进行HPLC分析，用于奈帕芬胺的定量。用STF替换为HPLC分析取走的溶液的体积。

2.3.3 闭环系统的USP 4型装置
USP 4型流通池装置可在不同条件下操作;它可以在开环和闭环系统模式运行。此外，它可以在不同的流速和温度下运行。有各种类型的池体可用于此装置。该装置可用于测试各种剂型，如片剂、粉末、栓剂、明胶胶囊等。因此，它是缓释和难溶性药物的首选方法。事实上，在2018年，Forrest等人就使用了该装置用于低水溶性化合物的纳米混悬剂。

USP 4型流通池装置的22.2mm池体，用于进行奈帕芬胺眼用混悬液的释放测试。简而言之，将0.5 ml的奈帕芬胺混悬液装入流通池。混悬剂面临的挑战是将混悬颗粒保留在池体中，因为那些通过过滤器的颗粒会导致错误的释放曲线。为了克服这一挑战，一个0.2μm的过滤器被夹在一个玻璃纤维过滤器(Whatman GF/D，孔径:2.7μm)和一个0.1μm的PVDF过滤器中间。将玻璃棉填充在流通池内，以避免颗粒进入溶出介质。然后，将流通池与流通池闭合头固定并安装到池体支架中。在50 mL无SLS和0.75% w/v SLS的STF中，在35±0.5°C下释放。以2 mL/min的流速测试释药曲线。在此过程中，没有观察到过滤器组合上的堆积或结块。样品(0.5 mL)在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min的设定时间间隔内取样，并使用“奈帕芬胺的HPLC分析”一节中提到的色谱条件进行HPLC分析。在本研究中，USP 4型装置在介质再循环的闭环系统模式下运行，因此在实验过程中没有观察到介质损失。同时，未观察到降解产物峰，说明该药物在释放介质中是稳定的。经体外释放试验，终浓度与理论浓度较符合。

2.3.4 水浴转瓶装置
水浴转瓶装置是一种非药典装置，非常罕见用于研究溶出。在Digesan Retard胶囊注册期间，向国家卫生警备局提交了使用水浴转瓶装置的溶出方法。在本研究中，0.2mL的奈帕芬胺混悬液放置在装有10mL溶出介质的水浴转瓶中。溶出温度为35℃±0.5℃，转速为50 rpm。溶解5、10、15、20、30、45、60、120 min后，取0.5 ml样品，8000 rpm离心5 min。取上清液放入高效液相色谱法定量释放药物分析。这个试验重复了三次。

2.3.5垂直Franz扩散池装置
2020年，Veiga等人为了寻找环糊精滴眼液制剂中奈帕芬胺的扩散，使用了配有醋酸纤维素膜过滤器的Franz扩散池。垂直Franz扩散池(FDC)装置一般用于局部半固体产品的IVRT。垂直Franz扩散池装置用于氟尼龙眼用混悬液。用12.5 mL STF完全填充受体室。采用不含SLS，含0.75% SLS的pH 7.4的STF进行释药试验。浴液温度设定为35℃± 0.5℃。采用PVDF 0.2 μm (Merck, Millipore)盘式过滤器作为人工膜。在分析开始前，用STF介质使膜饱和约30min。然后，在饱和膜上的供体室中，装入0.3 mL样品和0.3 mL介质，将白色硅环、旋紧玻璃池体和金属池体环依次放置在Franz扩散池上。所有的池体部件都借助夹子固定在一起。以600 rpm的转速搅拌Franz扩散池。在设定的取样时间点从受体室中取出0.5 mL的样品，按照“奈帕芬胺的HPLC分析”章节中提到的色谱条件进行HPLC分析。

2.3.6 分析方法验证
方法验证参数如专属性、线性、重复性、精密度、准确度、回收率等，按照分析方法验证程序应用于奈帕芬胺眼用混悬液IVRT法中释放药物的高效液相色谱检测，方法在ICH Q2(R1)指南中有详细说明。

2.4 百分比释放计算和统计分析
利用式(1)计算药物释放的百分比(%)，

其中所有参数都有自己的含义，如下所示。AT和AS分别为奈帕芬胺 HPLC色谱仪的测试峰面积和标准样品的峰面积。SC是标准浓度(mg/mL)，是根据溶解在稀释剂中的标准品总量和进一步稀释(如果有的话)计算出来的。TC为试验浓度(mg/mL)。这是通过考虑不同技术的稀释系数得到的。P代表基于所使用的奈帕芬胺测定的标准品效价。LC是测试产品的标示量，即1mg /mL。使用Excel和/或OriginPro 2018软件进行统计数据分析和绘图。三次测量的平均值(即n = 3)在最终的释放百分比与溶出时间图中取。数据以平均值±标准差(SD)的格式表示。

三、讨论与结果
使用各种溶出装置进行的体外药物释放实验的结果将在以下章节中提出和讨论。在进行药物释放试验之前，采用水浴转瓶法测定了奈帕芬胺原料药在含SLS和不含SLS的溶出介质中的饱和溶解度，然后在35℃下进行HPLC分析，观察SLS对溶解度的影响，并建立漏槽条件。无SLS时的最大溶解度值为0.03 mg/mL，添加SLS后的最大溶解度值增加了10倍，见表2。

表2 奈帕芬胺API在无SLS和有SLS的选定介质中的溶解度。

无SLS时在35℃介质中振荡1 h后的溶解度值为0.02 mg/mL，接近25℃水中的0.0197 mg/mL,但比环糊精配方的溶解度值(1.68 - 2.61 mg/mL)低一个数量级。在所有选择的技术和设备中，相对于样品上样量和介质体积，介质中API的最大浓度(0.024 mg/mL)远低于SLS介质中API的溶解度(0.32 mg/mL)。在所选择的四种装置中，所选择的样品上样量和介质体积均在漏槽条件内，因此不存在因奈帕芬胺饱和而导致药物释放的限制因素。

3.1 带透析袋的USP 2型装置
采用USP 2型装置，配以1000ml的溶杯，对奈帕芬胺眼用混悬液进行体外释放试验，可获得较好的流体动力学特性，为释放的药物从膜中透过提供了有利条件。选择1000 KD的MWCO透析袋，因为在混悬液中发现奈帕芬胺原料药的粒径为(2.05±0.25)μm，远远大于膜的孔径(最大2nm)，这在实验方法章节中有详细的讨论。因此，可以消除不溶性药物干扰释放曲线的可能性。使用USP 2型装置获得的奈帕芬胺眼用混悬液的释放百分比曲线如图3(a)所示。从图3(a)中可以清楚地看出，药物奈帕芬胺从制剂中逐步释放，并且在2小时内发现药物释放<40%。表面活性剂SLS(0.75%)的存在导致药物释放平均增加4%。

3.2 USP 4型装置(闭环)
USP 4型流通池溶出方法在介质体积和样品的可重复定位上提供了完全的灵活性。介质的循环是均匀的，程序是更加标准化的，因为颗粒在玻璃珠之间，因此颗粒没有被困住的可能。使用USP 4型装置获得的眼用混悬液中奈帕芬胺的释放百分比如图3(b)所示。药物释放曲线在60分钟内呈合理的递增趋势，最终变得更慢，并在120分钟内达到平台期。在不含表面活性剂SLS的条件下，溶出120 min后药物释放量为83%;在含有0.75% SLS的条件下，药物几乎完全释放(97%)。

3.3 水浴转瓶装置
选择水浴转瓶装置是为了与其他方法比较所获得的释放曲线。在装上样品进行HPLC分析之前，样品已经过离心;因此，可以消除不溶性药物颗粒对释放曲线产生影响的可能性。在水浴转瓶装置的帮助下获得的药物释放曲线如图3(c)所示，表明药物立即释放。Sanghvi等人报道茶碱类片剂在水浴转瓶装置中长达45分钟的溶出试验中，在水浴转瓶装置溶出5分钟后出现类似的立即释放曲线。当使用SLS和不使用SLS时，释放曲线会有显著的差异(约10%)。在达到平稳之前，最初的陡峭曲线可以解释为由于仪器中的高剪切力导致悬浮颗粒的快速增溶，从而得到澄清溶液，表明奈帕芬胺混悬液接近完全溶解。此外，在水浴转瓶中，悬浮颗粒往往会一次又一次地撞击玻璃管的壁，从而产生磨损，与通过流通池(FTC, USP 4)的流动相比，悬浮颗粒的溶解速度必然更快，因为流通池中通过玻璃珠的流动是层流的，非常温和。因此，水浴转瓶溶出法不适合奈帕芬胺眼用混悬液的IVRT研究。

3.4 垂直Franz扩散池装置
垂直Franz扩散池(FDC)装置主要用于局部和半固体制剂的方法开发。虽然与其他仪器相比，该仪器的操作程序不那么复杂，但池体受体室的体积有限，通常为12ml，因此，受体室中需要更多的溶剂来满足漏槽条件。作为液体制剂，FDC的样品注入具有挑战性。此外，在搅拌子的搅拌过程中，有可能形成气泡并被困在受体室中。

使用垂直Franz扩散池装置得到的奈帕芬胺眼用混悬液释放曲线如图3(d)所示。它显示释放曲线本质上是递增的。不到25%的药物在2小时内释放，这表明延迟或不完全释放。使用0.75%的SLS导致释放速率的提高，但没有达到接近完全释放。这主要是由于奈帕芬胺在12ml介质中的溶解度有限。虽然，由于眼部液体少和具有更好相关性的机会，低体积的介质对于眼科产品的研究是可取的。与Franz扩散池相比，水浴旋转装置中的药物释放速度更快。因为在前一种情况下，混悬液直接与介质接触，而在后一种情况下，在样品和介质之间有一层膜。

图3所示。使用(a) USP-2透析袋，(b) USP-4装置闭环，(c)水浴旋转装置，(d)垂直Franz扩散池获得的奈帕芬胺眼用混悬液的体外释放曲线。

3.5 分析方法验证
在2.3.1节所述的优化色谱条件下，奈帕芬胺标准品(即0.01 mg/ml)的HPLC图谱如图4(A)所示。在奈帕芬胺的保留时间为4.352 min时出现一个峰值。作为分析方法验证研究的一部分，我们通过生成不同浓度的奈帕芬胺标准溶液的色谱图来检查仪器响应的线性。图4(B)(a - g)为标准奈帕芬胺在1.1、3.3、5.6、8.9、11.1、13.4和17.8 μg/ml不同浓度下的覆盖HPLC图谱。由此可见，在(1.1 -17.8)μg/ml的浓度范围内，响应面积与奈帕芬胺标准溶液的浓度成正比。

图4所示。(A) 奈帕芬胺0.01 μg/ml标准制剂的HPLC图谱，(B)不同浓度下奈帕芬胺标准溶液1.1 μg/ml (A)、3.3 μg/ml (B)、5.6 μg/ml (c)、8.9 μg/ml (d)、11.1 μg/ml (e)、13.4 μg/ml (f)、17.8 μg/ml (g)的HPLC图谱，(c)眼科混悬液中奈帕芬胺的HPLC图谱，准确度分别为50% (A)、100% (B)、150% (c)。

为了更好地理解它，我们绘制了响应面积与浓度的相关性图，如图5所示。在1.1 μg/mL -17.8 μg/mL浓度范围内，浓度与面积线性关系的相关系数为R2 = 0.9999，在接受范围内。回收率的准确度为目标浓度的50%到150%。结果是99.9%-100%。图4C(a - c)为眼用混悬液中奈帕芬胺在50%、100%和150%三个浓度水平下的HPLC图谱。6个样品制备的精密度RSD在60 min时为0.90,12个样品制备的中间精密度总体RSD在60 min时为5。验证研究表明，体外释放试验方法对奈帕芬胺具有专属性，不受空白和稀释剂在主峰保留时间的影响。该方法是线性的、准确的、精密的。

图5所示。使用响应面积对不同浓度的标准奈帕芬胺获得的校准曲线如图4(B) (a - g)所示。

四、结论
在开发溶出方法的过程中，有必要对几种溶出技术进行评估，以获得理想的释放曲线，并实现以尽可能短的持续时间和尽可能低的介质体积的目标。本研究只选取符合上述要求的溶出仪进行研究。
采用高效液相色谱法对奈帕芬胺原料药在不同释放研究样品中的含量进行了测定。对分析方法进行专属性、准确度、精密度和线性验证，所有参数均在一般接受标准内。

由于体积小，垂直Franz扩散池技术似乎最适合于眼科产品的IVRT研究，然而，结果表明扩散池不适合该制剂。同样，水浴旋转装置也不适合，因为可以立即观察到快速释放，这可能是由于混悬颗粒受到的高剪切力所导致。使用USP 2型装置并通过透析袋进行扩散是为了在混悬液和释放的药物之间提供屏障。透析袋研究的结果没有达到预期的结果。

与本研究中使用的其他三种装置相比，USP 4型装置的释放曲线最好，重现性好，也许是因为它提供了温和流动的IVRT介质进入装有样品的池体。这清楚地表明USP 4型装置是最适合研究奈帕芬胺眼用混悬液IVRT的装置，这类产品的目标释放应该在较短的时间内递增释放，并且释放应该接近100%。只有USP-4符合这些标准，因此我们可以说在这里提出的4种技术中USP-4是最合适的。

五、参考文献

略