实时荧光定量 PCR(qPCR)自问世以来,就受到了广大生命科学实验工作者和医院检验工作者的极大关注,使得该技术得到了很快的普及。虽然qPCR技术目前应用方向十分广泛,但是仍碰到很多用户在实验中存在着由于不当操作而数据精度不高、重复性差、可信度差等问题。在这里,我们根据实际工作中的经验以及参考万谦等人[1]的研究,给大家详细说明一些有助于提高实验质量的操作技巧,希望能给大家带来一定的帮助。
1、引物的操作技巧:
使用引物设计软件进行设计时,在操作界面上设定相应的参数,扩增子参数一般设定范围为80 ~ 200bp,扩增子长度越短,扩增效率越高,可选择设定在110bp,110bp在后期的扩增中仅用10s,其余的参数均默认,软件即给出引物列表,一般选用评分高或者靠前的,因为评分越高或越靠前的引物对形成引物二聚体的可能越小。
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引物一般由试剂公司合成,为干粉状态,在溶解前,最好用高速离心机低温快速离心30s,使得引物干粉汇聚到管底,避免损失引物。引物收到后,需要先摸索引物的退火温度和终浓度,以达到较理想的qPCR扩增效果,其次测定引物的扩增效率,通常在非正式实验时,假定引物的扩增效率为100%,扩增产物在指数期呈现2n的增长。在正式实验时,考虑到引物的扩增效率实际不是100%,所以需要测定引物的扩增效率以修正结果。一个测定引物扩增效率的简单方法如下: 以cDNA样品或标准品为模板,依次稀释 101、102、103、104、105、106 倍,采用前期摸索好的qPCR扩增条件,得到6个Cq值,然后以log(模板浓度)为X轴变量,以Cq值为Y轴变量作回归直线图,得到直线的斜率,扩增效率 = 10( -1 /斜率) - 1,整个数据计算可以在Excel中完成,也可在qPCR软件中直接得出。
2、反应体系配制技巧:
正式实验时,每个样本至少3个重复,为了消除各重复之间的系统误差,可配置3.2个反应体系,将所需的所有试剂和模板加在同一个PCR管中,充分涡旋混匀后,再分装到3个重复孔中,这样可有效减小系统误差。另外,一些实验者为了节省试剂,采用10μL反应体系,我们认为这是不可取的,因为体积太小,加样误差会大,这样做得不偿失,建议使用20μL以上的反应体积。如上操作,可以在较大程度上消除由于加样不准造成的系统误差。
如表1所列,“优化前”是5管中分别依次加入模板和各反应试剂,最后得到的Cq值标准偏差为2.66;“优化后”是使用模板和各反应试剂的混合液,然后分装至5管中,最后得到的Cq值标准偏差为0. 32;由上述可见,数据精度得到极大的改善。
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司,配备高品质温度模块,采用光纤和CMOS的检测系统,高能LED的激发,提供高灵敏和可靠的数据。
▲ Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
参考文献:
[1]万谦, 陆华. 实时荧光定量PCR的一些操作技巧[J]. 实验科学与技术, 2012(S2):189-190.
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