如何做好近红外Western Blot实验，需要关注这5点

化学发光Western Blot的流程大家再熟悉不过，近红外荧光Western与化学发光步骤基本相似，但是有些小伙伴做不好荧光Western，小编给大家总结了做荧光Western的几点注意事项,赶紧下载下来看看吧！

Western Blot结果出乎意料，有可能是转印海绵垫惹的祸

您上一次何时更换的转印海绵垫？答案可能是“从不”。因为如果转印有效，为什么要更换？只有当海绵变成灰色和块状时，才会想起来更换。 但是具有多年Western Blot经验的Azure技术专家对定期更换转印海绵垫给出了必要性的解释，我们来具体看一看： ★ 为什么更换海绵垫很重要？★ 转印问题的常见根源是三明治结构的松紧度。三明治结构一定要紧！请定期更换转印海绵垫，以确保实验结果的准确性。使用额外的滤纸来填补海绵的磨损，可能会导致传输不一致。 我们都会定期更换海绵垫，因为它们会吸收污染物，随着时间的推移，转印海绵垫也会被污染。使用干净的海绵垫对荧光应用尤为关键，因为这些污染物会产生自发荧光，从而导致高背景。

Western blot除了化学发光检测，还有更优秀的近红外荧光检测方法

在介绍近红外荧光凝胶成像凝胶成像检测方法之前，我们来回顾下化学发光的历史：WB是目前蛋白检测的主要方法之一，1981年由尼尔·伯奈特（Neal Burnette）所著的《分析生物化学》中首次被提出，一直延续至今，仍有很多忠实的粉丝。

让蛋白质磷酸化清晰可见

WB 是检测和定量磷酸化蛋白质的重要实验方法，然而大家一直都说磷酸化蛋白 WB 不好做！WB 磷酸化蛋白曝不出条带的时候，会特别沮丧。Azure君在此给大家列出几点小建议，希望能帮助您改善一下实验结果。 1、样本是否表达： 查阅资料或通过预实验确定。 2、对照设置： 阳性和阴性对照。 总蛋白抗体对照，对于特定时间的特定样品，磷酸化和非磷酸化蛋白质的总和代表该特定蛋白质的总量。在相同的 WB 检测中， 磷酸化蛋白质的量增加通常伴随着非磷酸化蛋白质的降低。 3、内参设置： 根据实验选择合适的内参，如Actin、GAPDH 等

蛋白Marker不准，裁膜不易，多重荧光检测来帮您

Marker就像仪表盘一样，是个小细节，然而如果仪表盘不准，显示速度并非真实速度，你还敢开吗？同样的蛋白Marker对实验结果同样起着不可忽视的作用，Marker的主要作用就是用来指示蛋白条带对应的分子量大小，只有精确无误，实验才有说服力，可见细节对实验结果有着不可忽视的作用。

成像光学元件小科普!

当我们听到诸如光学系统，光电倍增管，二极管的时候，是不是觉得这些词汇太过专业了，虽然物理课学过，但印象总是很朦胧。今天小编就带大家来了解一下这些词汇都是啥（当然物理专业大佬除外哈~~~）

WB实验总做不好，那么如何进行WB实验质控呢？

做过WB实验的小伙伴都经历过成像时忐忑不安，出来结果时的彷徨无措，为什么条带没有出啦，为什么背景这么高，为什么受伤的总是我，看着旁边小伙伴漂亮的结果图，心生羡慕嫉妒，那么小编给大家整理总结了如何进行WB的质控和注意哪些检查点。

定量western blot ：为什么需要验证抗体

验证抗体对于结果的一致性和重复性是至关重要的，即确认抗体能特异性识别感兴趣的蛋白，抗体与其他蛋白的交叉反应性情况。在您的论文提交给期刊发表之前，经常需要验证抗体的特异性，但并非所有人都花时间进行验证。或者很多人都认为他们使用抗体进行了免疫共沉淀验证，因而不需要再通过蛋白质印迹进行验证。然而，抗体与抗原的亲和性高度依赖于实验条件，因此，验证您的试验方法中的条件适用于抗体与抗原的结合是十分重要的。 定量western blot尤其适用于确认获得的信号仅来自感兴趣的蛋白。如果没有进行抗体验证（并且验证荧光信号与蛋白质的量呈线性关系），将无法获得下游定量分析所需的准确度和精确度。 为确保实验质量，国际抗体验证工作组提供了五种不同的抗体验证方法，其中四种方法适用于western blot，他们建议至少使用其中两种方法进行抗体验证。 遗传策略 尽管这些方法已经被更新了，但在科研领域中的生物化学家对他们应该都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干扰（RNAi）在实验组和对照组中进行敲除或敲低实验，然后使用特异性抗体测定目标蛋白的荧光信号。处理后的目标蛋白质的表达很少甚至没有，所以观察到的任何信号都表明抗体存在交叉反应性。 如左图所示，将具有特定蛋白质的细胞裂解物进行western blot，分别使用两种不同siRNA分子敲低目的蛋白的表达，如泳道1和泳道2，与泳道C的对照组相比，我们可以看出siRNA脱靶带来的影响。

WB实验虐我千百遍，我待实验如初恋

大家都知道Western Blot时间周期较长，大致可以分为忙碌的第一天，和心痛的第二天，像极了爱情。人生若只如初见，何事秋风悲画扇。经历转瞬即逝的新手曙光后，便进入漫长的黑夜。 第一天，从最一步的配胶，到最后一步的孵育膜都极细心像极了爱情的萌芽期，需要精心的呵护。第二天经过繁琐的洗膜，孵二抗，洗膜，都需要耐心，之后便迎来了验证奇迹的一刻：显影，皆大欢喜或者一切皆空。像极经历爱情的磨合期，也有两个极端走向，婚姻的殿堂，或者以分手草草了事。 大多数实验室常用化学发光（ECL）方式，品牌，仪器众多，当然结果也良莠不齐。顿时回忆起当时做实验的点点滴滴，前面的工作繁琐而充实，一天下来觉得很满足，第二天既期待又紧张，期待有个完美的结果，但又担心事与愿违。大家怀揣着一颗忐忑不安的心走近暗室或者成像仪。随后便传来“为啥背景那么深，为啥没有目的条带，为啥分子量不对，被裁掉了&#823”一系列咆哮不绝于耳，大家都习以为常，相视一笑，接着做自己的事。经过忙碌的两天，只能被迫接受这种情况吗？

为什么要使用多重荧光方法进行westernblot的检测？

最近关于western blot数据造假的学术新闻成了科研的热搜词条，其数据造假包括，均存在一图多用，用了剪切，拼接，翻转，旋转，调整大小，故意抹平背景等P图手法，那我们来看看这些造假的数据。

上样质控和抗体验证用于Westernblot定量

今天的帖子的灵感来自于我和同事在教他们SDS-PAGE和western blot的实验交谈中。 他们对于qRT-PCR（R）和流式细胞术（R）精通，特别关心如何以及为什么使用某些上样质控，还有其它的技术被使用验证，蛋白质表达和抗体特异性的变化。

湿转和干转，哪种方法更适合您的蛋白实验？

对于一个完美的westernblot实验，蛋白在聚丙烯凝胶中根据天然分子量进行分离，蛋白被很好的从凝胶上转移到固相支持物上，然后通过特异性的抗体进行免疫检测。 对于转印来说，使用湿转的方法是比较好的，因为凝胶和膜都能够完全浸没在转印buffer中，在半干转的条件下，转印是在两个电极板之间发生，这种类型的转印装置可能影响蛋白的转印效率和膜上的截留能力。对于优化蛋白的转印条件，每个系统的优缺点都应该考虑进去。