【仪电分析】预混合饲料中维生素B1的测定-高效液相色谱法

【仪电分析】预混合饲料中维生素B₁的测定

高效液相色谱法

维生素B₁又名硫胺素或抗神经炎素，是最早发现的维生素之一，由吡啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。动物缺乏维生素B₁，碳水化合物就不能进行正常代谢，丙酮酸和乳酸在体内积聚，造成对神经系统、血液循环、消化系统等的机能障碍。

本方法参考GB/T 14700-2018《饲料中维生素B₁的测定》，适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B₁的测定。

一、方法原理

维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在242 nm处测定，外标法计算维生素B₁的含量。

二、主要仪器及试剂

a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器；

b.    超声波水浴；

c. 自动进样器；

d. 电子天平；

e. 针式过滤器；

f. 离心机。

三、实验方法

3.1 色谱参考条件

色谱柱：Welch C18， 200mm×4.6 mm×5μm；

进样量：20 μL；

流速：1.0 mL/min；

柱温：28 ℃；

波长：242 nm；

3.2 流动相配制

称取庚烷磺酸钠1.1 g、50 mg EDTA于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL水，同时加入25 mL冰乙酸、约10 mL三乙胺，超声使固体溶解，pH计调节溶液pH为3.7，过0.45μm滤膜过滤3-5次至泡沫明显减少，取800 mL该溶液，与200 mL甲醇混合既得，超声脱气30 min冷却至室温待用。

3.2 维生素B₁标准工作液配制

维生素B₁标准贮备液：取维生素B₁标准品（纯度大于99%）0.01g（精确至0.0001g），溶解于酸性20%乙醇溶液（pH=3.5-4.3）中并定容至100mL，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存，可使用3个月。该溶液含0.1mg/mL维生素B₁。

维生素B₁标准工作液：准确吸取5 mL维生素B₁标准贮备液于50 mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准工作液浓度为1000μg/mL，该溶液存于2 ℃~8 ℃冰箱可以使用48h。

用标准工作液梯度稀释至100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL。

3.3 试样溶液的制备

维生素预混合饲料提取液：称取50 mg EDTA于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL去离子水，同时加入25 mL冰乙酸、约10mL三乙胺，超声使固体溶解，调节溶液pH=3~4，过0.45 μm 滤膜，取800 mL该溶液，与200 mL甲醇混合既得。

称取试样0.05 g（精确到0.0001g），置于25mL棕色容量瓶中，加入提取液约40 mL，边加边摇匀，置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇匀。取少量溶液于离心机上4000r/min离心10 min，上清液过0.45μm微孔滤膜，上HPLC测定。

测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积外标法定量。

四、实验结果

4.1 标准工作曲线

维生素B₁工作曲线见图1： 

图1 标准工作曲线

4.2 标准工作液色谱图

标准工作液色谱图见图2：

图2 标准工作液色谱图

4.3 预混料实际样品色谱图

实际样品色谱图见图3：

图3 实际样品色谱图

4.4 计算

y=1509141.25×0.00003-1.0258=44.25μg/mL

0.05g样品中含维生素B₁：44.25×25=1106.25μg=1.10625 mg

1kg样品中含维生素B₁：1.10625×20=22.125 mg/g=22.125 g/kg