【仪电分析】预混合饲料中维生素B12的测定-高效液相色谱法

【仪电分析】预混合饲料中维生素B₁₂的测定

高效液相色谱法

维生素B₁₂不仅参与牲畜、禽类、鱼类体内碳基团的代谢，而且参与牲畜、禽类、鱼类核酸和蛋白质的合成，促进了细胞的发育和成熟，使牲畜、禽类、鱼类增重加快。当维生素B₁₂ 缺乏时，糖在牲畜、禽类、鱼类组织中的利用过程发生障碍，牲畜、禽类、鱼类表现为食欲减退，生长慢或失重，严重消瘦，异食癖和极度贫血死亡。所以维生素B₁₂ 添加剂作为牲畜、禽类、鱼类饲料中必不可少的成分，在饲料产业中有着广泛的应用。

本实验参考GB/T 17819-2017 《添加剂预混合饲料中维生素B₁₂的测定 高效液相色谱法》，本方法适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B₁₂的测定。

一、方法原理 

维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在361nm处测定，外标法计算维生素B₁₂的含量。

二、主要仪器及试剂

a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器；

b. 超声波水浴；

c. 自动进样器；

d. 电子天平；

e. 针式过滤器；

f. 乙腈：色谱纯；

g. 甲醇：色谱纯。

三、实验方法

3.1 色谱参考条件

色谱柱：Welch C18，200 mm×4.6 mm×5μm；

进样量：10 μL；

流动相：水+乙腈

时间梯度0-10 min 5%乙腈，10-25 min 5%→35%乙腈，25-30 min 35%乙腈，30-35 min 5%乙腈；

流速：1.0 mL/min；

柱温：30 ℃；

波长：361 nm；

3.2 维生素B₁₂ 标准工作液配置

将0.1 g维生素B₁₂ 标准物溶于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，使该标准储备液的浓度为100 μg/mL。置4 ℃冰箱保存，可保存期3个月。

分别配置浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的工作液，待上机。

3.3 试样溶液的制备

称取维生素混合饲料0.10 g，精确至0.0001 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入100 mL水，在超声波提取器中超声提取15 min，取适量溶液离心后取上清液，过滤，滤液过0.45 μm（或0.20 μm）滤膜，待上机。

测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间按定性，峰面积外标法定量。

四、实验结果

4.1 标准工作曲线的绘制

维生素B₁₂工作曲线见图1：

 图1 维生素B₁₂工作曲线

4.2 标准工作液色谱图

标准工作液色谱图见图2

 图2 标准工作液色谱图

4.3 预混料实际样品色谱图

实际样品色谱图见图3：

 图3 实际样品色谱图

4.4 计算