人和动物细胞的标本采集的选择与处理

    人和动物细胞的标本采集的选择与处理是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若选择与处理不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将基本要求和注意事项叙述如下：

一、标本采集的基本要求

(一)标本的采集

1．新鲜标本组织易于培养成功，取材时应在4～6h内尽快能制作成细胞，尽快培养，若不能即时培养，应将标本组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若标本组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，将其切成1cm3以下的小块于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。

2．若对所取标本材料怀疑有污染，应将所取标本组织在含高浓度青、链霉素(400～800U／ml)甚至加入适量的两性霉素B的培养液于4℃下存放2h以上，再用PBS洗2～3次，以确保所取标本材料无菌。

3．所取标本材料应避免紫外线的照射；避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。

4．标本取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。

5.原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。

(二)材料与器材

    需要取材的各类组织；平衡盐溶液；手术刀、眼科剪、镊子、止血钳、采血管；平皿、小烧杯、三角烧瓶、无菌的大头针、75％酒精棉球；消毒过的木板、蛋架等。

二、各类组织标本的取材技术

(一)皮肤和黏膜标本的取材

1.皮肤和黏膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取白于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2～3cm3即可，局部不留瘢痕，但取材时不要用碘酒消毒。

2．若培养上皮细胞，取材时不要切取太厚，尽可能去除所携带的皮下或黏膜下组织；若培养成纤维细胞，则反之。

3．皮肤黏膜因表面细菌、真菌很多，标本取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素B漂洗、浸泡。

(二)内脏和实体瘤标本的取材

1．内脏标本除消化道外基本是无菌的；实体瘤标本若没有坏死或溃破基本也是无菌的。

2．内脏和实体瘤标本取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位。

3．实体瘤标本取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染。

4．由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难，因此要除去不需要的部分如血管、神经，尤其结缔组织。

(三)血液细胞标本的取材

1．一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞，操作严格无菌，尽量新鲜使用。

2．血液细胞标本取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8～10U／ml血，肝素浓度过大导致溶血。若从血站取来的献血员的血液，因常用含枸橼酸盐抗凝，对此类血标本不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞以免加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。

(四)骨髓、羊水、胸／腹水细胞标本的取材

严格无菌操作，注意抗凝，尽快分离培养。离心后，用无钙、镁离子PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。

(五)动物组织取材

1．鼠胚组织取材

(1)引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，将其整个浸泡在含有75％酒精的烧杯中2～3s(时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力)。

(2)从含有75％酒精的烧杯中取出动物，在消毒木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定。

(3)更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎，置于无菌平皿中。

2．幼鼠胚肾(或肺)取材幼鼠采用上述方法处死消毒后：

(1)腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧，然后采用无菌法打开胸腔取肺。

(2)或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开、游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。

(六)鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材

1．取孵化至适当胚龄(9～12d)的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔画出气室和胚体位置。

2．将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，用75％酒精棉球擦干，再经碘酒、75％酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳，再用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚，再用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。