成体神经干细胞的培养及诱导分化

    成体干细胞(adult stem cell，AS)，相对ES而言。也称为组织干细胞，是一种存在于不同组织中的未分化的细胞，并长期保持自我更新的能力，具有分化为该组织特定形态特征和功能的各种类型细胞。但成体干细胞是具有可塑性的，在特定培养条件下可从一种组织类型分化为另一种组织类型，如造血干细胞能分化为神经干细胞，尽管其机制不明，但提示特定的培养细胞生长的微环境(niche)对细胞的分化起着至关重要的作用。本节主要介绍成体神经干细胞、表皮组织干细胞及间充质干细胞的培养和诱导。

一、成体神经干细胞的培养及诱导分化

神经干细胞在胎儿脑内主要集中在脑室外侧的室管膜区(位于前脑)、下脑室区、海马区、嗅球、脊髓、小脑和大脑皮质等，将这些中枢神经系统的干细胞在促有丝分裂因子FGF一2和EGF等存在的情况下体外增殖，再用其他细胞因子诱导细胞分化。

(一)材料

1.动物不同年龄段的小鼠脑组织。

2．培养液

(1)完全培养液：DMEM或DMEM／F12(1：1)，含有4．5g／L葡萄糖、2mmol／L L谷氨酰胺、0．1mmol／L 8巯基乙醇、1mmol／L丙酮酸钠、O．1mmol／L非必需氨基酸、15％FBS、B27复合物、20μg／L bFGF和10pg／L EGF。

(2)无血清培养液“DMEM／F12(1：1)，含2％N2复合物、2％B27复合物、1％BSA蛋白、20gg／L bFGF、10μg／L EGF，5mg／L胰岛素、5～50mg／L转铁蛋白、20nmol／L孕酮、100μmol／L腐胺、30μmol/L亚硒酸钠。

3．试剂：D一Hanks液、0．25％胰蛋白酶、O．02％EDTA、10mmol／L HEPES、O．001％DNase。

4．器具：多聚赖氨酸(50gg／ml)处理的载玻片或包被成纤维细胞的6孔培养板、手术器械、无菌平皿等。

(二)方法

1.神经干细胞培养

(1)将12～15日龄小鼠断颈处死，于无菌条件下分离脑组织的下脑室区和海马区的齿状回。

(2)将脑组织置于无菌平皿内，用D—Hanks液洗2次，将组织剪碎，用O．25％胰蛋白酶O．02％EDTA、O．001％Dp4ase、10mmol／L HEPES于37℃消化20min后，加入含血清的培养液终止反应。

(3)移人离心管，以50Or／min低速离心5min，去上清液。将细胞沉渣用完全培养液再悬浮，并接种至培养瓶(50ml)和载有处理过的盖玻片的培养皿内，置于37℃、5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。

2．神经组织块培养将剪碎的SVZ组织块平铺在包被成纤维细胞的6孔培养板上，静置lOmin，移入37℃，5％CO2孵箱中倒置培养3～4h，待组织块确已黏附在培养板上，再加入3m完全培养液，继续培养。48h后更换新鲜的预温的完全培养液。

3．神经干细胞的传代培养上述神经干细胞或神经组织块经培养7～10d，可形成神经球形克隆。成年鼠则需培养10～14d。用吸管轻轻吹打球形克隆使之成单细胞悬液。如吹打困难，可用O．25％胰蛋白酶O．02％EDTA进行消化，消化完毕后轻轻倒掉消化液，用完全培养液洗1次，加培养液轻轻吹打成分散的细胞悬液，接种到新的培养瓶中，每瓶细胞数为1×105个，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。每隔3～5d换液1次，每6～10d重复传代1次，培养条件不变。

(三)结果及鉴定

主要依据神经细胞形态特征及化学标志进行鉴定。

1．培养的神经球形克隆细胞在去除生长因子和降低血清浓度(2％～5％)后，悬浮培养可诱导神经于细胞分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等三种细胞。

2．神经元的胞体较大，有不同长短的突起，有一个或多个树突，细胞核较大。神经元标志有特异性烯醇化酶、微管相关蛋白和神经丝等。

3．星形胶质细胞的胞体较大，呈不规则星状，胞体丰富，胞核呈圆形，有1～2个核仁．胞突较多且较细。其细胞标志有神经胶质纤维酸性蛋白和谷氨酞胺合成酶等。

4．少突胶质细胞胞体小，胞突短而少为其特点，胞核圆形，胞质较少。其细胞标志有半乳糖脑苷脂，表达在胞膜和髓鞘上；另一标志为髓鞘碱性蛋白，是少突胶质细胞在形成髓鞘前表达的特异性蛋白。用免疫组化法可对上述细胞的标志进行检测。