免疫沉淀实验程序

免疫沉淀实验程序

一、溶液准备：

elisa试剂盒RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.4 , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧胆酸钠 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 （ aprotinin ） , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ）

PBS （ pH7.4 ） ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl

1×样品缓冲液：65mM Tris-HCl （ pH8.0 ） , 10% （ v/v ） 甘油 , 2.3%（w/v） SDS , 0.01% 溴酚蓝，1% DTT

二、实验程序：

1、用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收获细胞并计数。

2、按1ml/107个细胞用预冷的RIPA缓冲液来裂解细胞，4℃摇1h。

3、10000g，4℃离心20min，取上清液。

4、用PBS清洗蛋白A/G琼脂糖颗粒两次，用RIPA缓冲液稀释琼脂糖颗粒至浓度为50%。

5、按每50ml颗粒悬浮液需1ml细胞裂解液计算需要裂解液体积，取相应体积数的裂解液在4℃条件下摇10min。10000g，4℃离心10min，将上清转移到新管中。

6、按每5×106个细胞加0.5ml细胞裂解液，取相应的裂解液到新管中准备免疫沉淀（IP）反应，每个反应中加入8-15 μg抗体，冰上摇3h。

7、elisa试剂盒加50ml 50%颗粒悬浮液，4℃摇1h。

8、10000g离心15s，弃上清。

9、用1ml RIPA缓冲液洗涤颗粒两次，以除去无特异结合的蛋白，然后用1ml PBS洗涤3次。

10、60μl样品缓冲液悬浮颗粒，95℃煮沸5min：SDS-PAGE电泳前样品10000g短时离心15s。