免疫沉淀实验程序
一、溶液准备:
elisa试剂盒RIPA缓冲液:50mM Tris-HCl pH7.4 , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧胆酸钠 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin )
PBS ( pH7.4 ) :10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl
1×样品缓冲液:65mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 10% ( v/v ) 甘油 , 2.3%(w/v) SDS , 0.01% 溴酚蓝,1% DTT
二、实验程序:
1、用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收获细胞并计数。
2、按1ml/107个细胞用预冷的RIPA缓冲液来裂解细胞,4℃摇1h。
3、10000g,4℃离心20min,取上清液。
4、用PBS清洗蛋白A/G琼脂糖颗粒两次,用RIPA缓冲液稀释琼脂糖颗粒至浓度为50%。
5、按每50ml颗粒悬浮液需1ml细胞裂解液计算需要裂解液体积,取相应体积数的裂解液在4℃条件下摇10min。10000g,4℃离心10min,将上清转移到新管中。
6、按每5×106个细胞加0.5ml细胞裂解液,取相应的裂解液到新管中准备免疫沉淀(IP)反应,每个反应中加入8-15 μg抗体,冰上摇3h。
7、elisa试剂盒加50ml 50%颗粒悬浮液,4℃摇1h。
8、10000g离心15s,弃上清。
9、用1ml RIPA缓冲液洗涤颗粒两次,以除去无特异结合的蛋白,然后用1ml PBS洗涤3次。
10、60μl样品缓冲液悬浮颗粒,95℃煮沸5min:SDS-PAGE电泳前样品10000g短时离心15s。
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