DS3000应用|微卫星不稳定性(MSI)分析在一胰腺癌切除术临床案例术后长期肿瘤基因型追踪分析中的应用

日立诊断

2021/06/04 10:05

阅读：241

背景

胰腺导管腺癌（PDA）是一种致死率极高的疾病，即使在根治性切除术后也会复发。虽然建议进行辅助化疗，但中位无复发生存期<2年，约三分之二的患者在术后5年内出现复发。转移一般是一种全身性疾病，对转移复发的手术治疗在大多数情况下不是一种合理的治疗选择。然而，部分报告显示手术切除PDA的孤立性转移瘤有利于生存。

KRAS基因中一种普遍存在的突变在胰腺癌的发生过程中起着起始基因的作用，随后肿瘤抑制基因如TP53，CDKN2A，SMAD4导致侵袭性和转移性疾病前体的进展。一项研究表明，这些突变的数量与PDA患者的术后生存率显著相关。最近的遗传学研究也发现PDA之间的突变谱存在相当大的差异，这可能广泛对应于不同的分子亚型。即使存在转移，阐明PDA遗传背景的临床意义对于预测有效的长期生存和对患者进行选择性手术治疗也是必要的。

案例

一位42岁的女性因上腹部疼痛伴胰腺肿块转诊到本院，患者有胰腺分支导管型导管内乳头状粘液性肿瘤家族史。患者因胰管受累，诊断为胰腺导管腺癌（PDA）并发胰腺炎。病人接受了远端胰腺切除术，病理检查显示为管状腺癌。首次出现后6个月和43个月分别发现孤立性肝转移瘤和肺转移瘤，随后进行转移性切除术。

本例胰腺癌患者在原发肿瘤切除和异时转移瘤切除术后存活8年以上。PDA可能与调节其生物学行为的遗传特征有关。检测其肝和肺切除标本、原发性动脉导管未闭和复发性肿瘤的基因图谱，发现在密码子12处具有相同的KRAS突变，而主要肿瘤抑制基因如TP53、CDKN2A和SMAD4没有突变。

实验方法

为了评估原发性动脉导管未闭切除术后长期过程中发生的遗传学事件，我们利用从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的基因组DNA，通过基于PCR扩增子的靶向测序，对原发性肿瘤和肝肺转移的特征进行了描述。

1）DNA提取：

使用GeneRead-DNA-FFPE试剂盒（Q公司）从非肿瘤组织（脾脏）、原发性PDA和肝/肺转移瘤的FFPE切片中提取基因组DNA，并进行定量。

2）基因PCR扩增子的靶向测序：

原发性和肝/肺转移性肿瘤的突变谱通过基于前面描述的PCR扩增子的靶向测序来确定。使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2和定制Panel（T公司）扩增10到60ng的基因组DNA。

Ion Ampliseq Cancer Hotspot Panel v2用于扩增207个覆盖50个癌基因主要热点的扩增子。

定制Panel的扩增子包括18个在PDA中频繁突变的基因（ARID1A，BRAF，CDKN2A，CTNNB1，GNAS，IDH1，KDM6A，KRAS，MAP2K4，PIK3CA，RBM10，SF3B1，SMAD4，STK11，TGFBR1，TGFBR2，TP53和RNF43）。

通过Ion Personal Genome Machine System and the Ion Personal Genome Machine Sequencing 200 Kit（T公司）进行测序并分析。

3）微卫星不稳定性分析：

微卫星不稳定性（MSI）试剂盒（P公司）利用5个单核苷酸标记物（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27）和2个五核苷酸标记物（Penta C和Penta D）鉴定肿瘤和正常组织DNA标本中的MSI是否来自同一患者。

DS3000基因分析仪被用于分离荧光标记了的PCR产物，结果通过GeneMaker 3.0软件（SoftGenetics）进行分析。

如果肿瘤在至少2个单核苷酸标记物中表现为不稳定，则将其归类为MSI-H；如果在5个标记物中有1个标记物观察到MSI不稳定，则将其归类为MSI-L；如果在5个标记物中未检测到不稳定，则将其归类为微卫星稳定（MSS）。

结果

所有3个肿瘤病灶样本在密码子12处都有相同的KRAS突变（p.G12V，COSM520），肝和肺肿瘤与原发性PDA基因相同。有趣的是，在胰腺肿瘤发生的主要抑癌基因（如TP53、SMAD4和CDKN2A）和其他在PDA中常见突变的基因中没有发现突变。此外，研究表明新的突变并没有在肝和肺转移瘤中累积。原发性和复发性肿瘤在基于多重PCR的MSI分析中都为MSS。

微信推送-MSI-图片1-updated.png

结论

通过手术成功控制的PDA可能属于在分子水平上更有利生存的的一个亚型。因此，我们采用了遗传学方法来确定突变谱。在3个病灶中均发现相同的KRAS突变，提示转移可能起源于原发性PDA。一般认为肿瘤细胞会在进展过程中获得额外的突变，然而，在PDA中常见的其他突变如TP53、CDKN2A和SMAD4在原发性PDA和转移瘤中均未发现。另外，MSI的发生率及其与胰腺癌预后的关系可能因所用方法而异。

在这里，我们描述了一例PDA患者，在原发性肿瘤切除术后，肝和肺孤立性复发性肿瘤的后续手术治疗中存活了8年以上。我们进一步描述了肝脏和肺部原发性和复发性肿瘤的连续切除是如何获得长期生存的，这些肿瘤显示出相同的KRAS突变，而在主要肿瘤抑制基因中没有发现其他突变。PDA的结果可能与调节其生物学行为的基因图谱有关。孤立性转移瘤的手术治疗可作为胰腺癌患者的一种治疗选择。

（Hiroki Sato，MD 旭川医科大学医学系）

Source：

Sato H, Sasajima J, Okada T, Hayashi A, Kawabata H, Goto T, Koizumi K, Tamamura N, Tanabe H, Fujiya M, Chiba Si, Tanino M, Ono Y, Mizukami Y, Okumura T. Resection for pancreatic cancer metastases contributes to survival: A case report with sequential tumor genotype profiling during the longterm postoperative course. Medicine 2020;99:25(e20564).

（仅供科研使用 For Research Use Only）

日立DS3000基因分析仪顺利通过公安部刑事技术产品质量监督检验中心验证