双向电泳的样品的制备

双向电泳的样品的制备

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并 没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：
1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；
2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes), 主要包 括尿素（Urea）和硫脲（thiourea ）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如 CHAPS与 Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducingagents）  ，

最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP ）等。当然，也可以选择性的加入 Tris-base, 蛋白酶抑制剂以及核酸酶。 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐 类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条，这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过 超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。 因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于 2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细 胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

一、细胞样品

1.    细胞培养，加药与处理。

2.    胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500 ｇ，5min) ，弃上清,  再次离心，去 尽残液（非 常 重 要 ！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细 胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低样品的

盐浓度。

加入 5 倍体积裂解液，混匀（或将 1×106 细胞悬于 60～100µ l 裂 解 液 中 ）。

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在 4℃放置 15 分钟。

4.    15,000转，4℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4℃离心 30 分 钟 ）。

5.    收集上清。

6.    测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assaykit)。

7.    分装样品，冻存于－70℃。

二、组织样品

1.   碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2.   将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分钟。

4.   15,000 转，4℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4℃离心 30 分 钟 ）。

5.   收集上清，测定蛋白浓度。

6.   分装样品，冻存于－70℃。

注意事项：

1.   8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否則 PMSF 会失去活性。

2.   40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3.   细胞清洗――大多用 PBS，若 PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹 ， 则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。