Western Blotting 常见问题解答

Western Blotting 常见问题解答 1、胶片上存在反转印象（如：亮的条带、黑的背景）？原因：HRP的浓度过高； 解决：稀释HRP至少10倍。 2、膜上有黄色或棕色的沉积？原因：HRP的浓度过高； 解决：稀释HRP至少10倍。 3、在暗室中条带过于明亮？原因：HRP的浓度过高； 解决：稀释HRP至少10倍。 4、条带的发光时间持续了至少8小时？原因：HRP的浓度过高； 解决：稀释HRP至少10倍。 5、信号太弱或没有？原因： 1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退； 2.抗原或抗体的浓度不够； 3.转印不成功； 4.HRP或其他底物的效价降低。 解决： 1.稀释HRP至少10倍； 2.增加其浓度； 3.寻找合适的转移方法和条件； 4.选择其他的合适底物。 6、背景高？原因： 1.HRP浓度过高； 2.封闭无效； 3.不适合的封闭试剂； 4.洗涤不充分和洗涤液的量； 5.胶片曝光过度； 6.抗原或抗体的浓度太高。 解决： 1.稀释HRP至少10倍； 2.寻找合适的封闭方法； 3.选用其他的封闭试剂； 4.增加洗涤的时间,次数； 5.减少曝光时间； 6.稀释抗原或抗体。 7、蛋白质条带上有空泡影像？原因： 1.蛋白质没有被充分转印； 2.膜没有预先浸湿； 3.在胶片和膜之间有气泡。 解决： 1.寻找合适的转移方法和条件； 2.在转印前充分浸湿； 3.在暴光之前赶走气泡。 8、胶片上背景弥散？原因：HRP标记的抗体出现了积聚； 解决：稀释HRP至少10倍。 9、无特异性条带？原因： 1.HRP浓度过高； 2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上。 解决： 1.稀释HRP至少10倍； 2.在操作过程中不要加SDS。