聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

2016-01-14 07:37

浏览：181次

资料摘要：

聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 PCR进行的基本条件是：（1）以 DNA为模板（在RT－PCR中模板是RNA）；（2）以寡核苷酸为引物；（3）需要4种dNTP作为底物；（4）有 Taq dna聚合酶。 PCR每一个循环由三个步骤组成：（1）变性　　加热模板DNA，使其解离成单链；（2）退火　　降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合；（3）延伸　　在适宜温度下，Taq DNA聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35个循环后，目标DNA 片段可能性扩增可达235倍。 PCR的影响因素：（1）模板单、双链DNA或RNA都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。为提高PCR反应的特异性，所加DNA模板量应作相应的调整，如克隆DN A（ng），染色体DNA（μg），待扩增片段（104拷贝数量）来作起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA的蛋白质。（2）引物引物是决定PCR结果的关键。引物的设计应遵循以下原则： ①引物的长度一般为18-25个碱基 ②G+C含量一般为40-60% ③碱基的随机分布（3）反应温度和时间　 PCR涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至1分钟，过高温度或持续时间过长会降低TaqDNA聚合酶活性和破坏dNTP分子。退火温度可选择比变性温度（Tm ）低2-3℃，变性温度按Tm =4（G+C）%+2（A+T）%计算。在Tm 值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR特异性，退火时间一般为0.5-1分钟。延伸温度为72℃，时间与待扩增片段长度有关，一般1Kb 以内片段延伸时间为1分钟，如扩增片段较长可适当增加时间。（4）Taq DNA聚合酶目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和大肠杆菌表达的重组TaqDNA聚合酶（Ampli TaqTM ）。两种酶都有5’-3’外切酶活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR中，它们可以相互替代，催化典型的PCR所需酶量为l～2.5单位。酶量偏少则PCR产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。（5）dNTP浓度 dNTP在饱和浓度（200 μmol／L）下使用。由于 dNTP溶液有较强酸性，配制时可用 l mol／L NaOH溶液将其贮存液（50 mmol／L）的 pH调至 7.0～7. 5。分装小管于-20℃保存。过多冻融会使其降解。（6）PCR缓冲溶液在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而钙离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错配率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在 0. 5～2. 5 mmol／L之间。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，尤其要调整Mg+2浓度至最佳。本实验从小鼠肝脏中提取的基因组DNA中扩增β-actin基因，其片段长度为800 bp。【器材】 PCR扩增仪、掌式离心机、0.5ml PCR 管【试剂】 1．PCR扩增试剂盒 2．引物1：5ˊATCTGGCACCACACCTTCTACAATG 3ˊ 引物2：5ˊCGTCACACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC 3ˊ 3．标准DNA：DL 2000 【操作步骤】 1.在0.5ml PCR塑料管中加入下列物质，并混匀。 10×PCR buffer(free Mg +2) 5μl

下载本篇资料：

资料文件名：

资料大小

下载

复件公司logo001.PNG

50KB

免费下载

DNA分子的限制性内切酶消化标准操作规程(

基因表达 RT

相关资料

葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法)

英文名称：PLP；Pyridoxal-5-phosphatemonohydrate；Pyridoxal-5-monophosphoricacidester；3-Hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methylisonicotinaldehyde5-phosphate；Codecarboxylase 其他名称：5-磷酸吡哆醛；吡多醛5-单磷酸酯；3-羟基-2-甲基-5-[(膦酰氧基)甲基]-4-吡啶甲醛一水合物；磷酸吡醛素；吡哆醛-5-磷酸酯；3-羟基-5-羟甲基-2-甲基异烟酰；辅脱羧酶 CAS号：41468-25-1 C8H10NO6P?H2O=265.15 级别：AR 含量：≥99.0% 维生素B6：≤0.5% 干燥失重：≤10.0% 重金属：≤20ppm PH(0.25%agSolution)：2.6～3.0 性状(以下信息仅供参考)：类白色至淡黄色或黄色粉末。熔点140～143℃。几乎无气味。无味。见光缓慢分解。易溶于甲酸、含水吡啶和稀碱液，微溶于水、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和苯。水溶液在冷而避光处很稳定，0℃时3周

微生物检测冻干粉质控菌种说明书

阿尔茨海默病（AD）是一种全球范围内患病人口较多的神经退行性疾病。自发病起，患者的认知功能会逐渐衰退，病理表现为大脑中β淀粉样蛋白（Aβ）的累积、过度磷酸化的tau蛋白导致的神经纤维缠结以及神经炎症。 cGAS-STING通路是哺乳动物细胞检测外源DNA，并激活先天免疫反应的重要通路。它在缺血性脑损伤、帕金森病、亨廷顿病、脊髓侧索硬化症等神经疾病的发生发展中有重要作用，但是，cGAS-STING通路是否参与AD仍不清楚。近日，由中国科学院昆明动物研究所的曾健雄和美国南加州大学的赵振领衔的研究团队，在国际顶尖杂志《自然·衰老》发表关于cGAS-STING通路参与AD的最新研究成果[1]。他们发现在人类AD患者和衰老小鼠大脑中，cGAS与细胞质中的双链DNA结合，激活cGAS-STING通路，而敲除Cgas可以抑制AD模式小鼠的Aβ累积、神经炎症以及认知衰退。他们还发现，STING抑制剂H-151可以显著抑制AD模式小鼠大脑中cGAS-STING通路的激活，抑制AD病理进程。总的来说，这项研究揭示了先天免疫通路cGAS-STING和AD之间的重要联系，靶向

雌二醇特价促销 350/25g

英文名称：Estradiol；1,3,5-Estratriene-3,17beta-diol；17beta-Estradiol；3,17beta-Dihydroxy-1,3,5(10)-estratriene；Dihydrofolliculin 其他名称：β-雌二醇；雌甾二醇；雌甾-1,3,5-(10)-三烯-3β,17β-二醇；β-1,3,5(10)-三烯-3,17β-二醇；3,17β-二羟基-1,3,5(10)-雌甾三烯-3,17β-二醇；β-雌激素 CAS号：50-28-2 C18H24O2=272.38 含量：≥98.0% 熔点：173～179℃ 比旋光度：+76～+83°(C=2,5mol/LHCl) 水分：≤3.5%(KARLFISCHER) 性状(以下信息仅供参考)：白色或乳白结晶性粉末；无臭。本品在二氧六环、丙酮中溶解，在乙醇中略溶，在水中不溶。比旋度取本品，精密称定，加二氧六环溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定。用途：本品仅供科研，不得用于其它用途。保存：2~8°C

红豆杉染色体水平基因组测序完成

紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物。紫杉醇生物合成途径已研究多年，而超大的基因组和复杂的代谢路线是途径解析的主要限制因素。中国科学院天津工业生物技术研究所与西北工业大学、深圳华大生命科学研究院等合作，首次完成了喜马拉雅红豆杉超10Gb的染色体水平的全基因组测序，并通过复杂基因组组装与分析，解析了红豆杉中生物合成紫杉醇的关键基因簇，探索了紫杉醇合成途径的起源与进化机制，为完全解析紫杉醇生物合成途径奠定了重要基础。全基因组倍增事件是开花植物提升环境适应能力，并逐渐替代裸子植物，遍布地球的主要原因。通过对裸子植物喜马拉雅红豆杉基因组的进化分析，研究发现在地球上存活更久的红豆杉却几乎没有经历过明显的全基因组倍增事件，而是发生了大量的基因串联重复事件，其比例超过了几乎所有已知的开花植物。大量基因串联重复导致红豆杉中的一些基因家族急剧扩张，随着这些家族重复基因的功能分化，红豆杉进化出非常复杂的代谢物合成和转录调控网络。例如，与紫杉醇合成密切相关的细胞色素P450酶家族与酰基转移酶家族，通过串联复制都产生了超过50份基因拷贝，如此多的重复基因为红豆杉进化出极其复杂的紫杉醇合成途径提供了遗传基础。迄今为止，已在紫杉科的植物中发现了超过500种具有紫杉烷类天然产物。因此，大量的基因串联重复是红豆杉中紫杉醇合成途径形成的主要进化机制，也可能是红豆杉能在地球上存活至今的重要原因之一

产品推荐