一、试验原理：  丁酸梭菌又叫酪酸梭菌，是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈杆状或稍有弯曲，周身鞭毛，能运动。酪酸梭菌是人的正常肠道菌群之一，有氧条件不生长，革兰氏染色为阳性，能够发酵乳糖、麦芽糖、棉籽糖、甘露醇等碳水化合物产酸，不发酵山梨醇，硝酸盐还原试验为阴性。二、试验步骤及结果  1、将1小包丁酸梭菌活菌散溶解于含9mL无菌生理盐水的试管内，取1mL菌液加入至厌氧疱肉培养基内，置于35℃恒温箱内培养。培养24h后，疱肉培养基浑浊，并产生大量气泡。图1疱肉培养基    2.用接种环挑取疱肉培养基菌液划线接种于TSA平板，放入厌氧袋内，并放入厌氧产气包，置于35℃恒温箱内进行厌氧培养，另划线接种TSA平板，置于有氧条件下35℃恒温箱进行培养。图2 TSA平板上的菌落形态  培养24h后，有氧条件培养下的TSA平板上无任何菌落生长，厌氧条件培养下的TSA平板细菌生长良好，菌落为白色且形状不规则，沿接种线向周围扩散生长，表明该菌生长条件为严格厌氧，且具有较强动力。  3.从纯培养后的TSA平板上挑取菌落进行革兰氏染色，在油镜下观察菌体形态。图3 油镜下的菌落革兰氏染色  该菌的革兰氏染色为阳性，显微镜下菌体为紫色杆状，两端钝圆，部分菌体稍有弯曲。  4.挑取TSA上纯培养的单菌落至9mL无菌生理盐水试管内，分别接种于乳糖、麦芽糖、棉籽糖、甘露醇、山梨醇和硝酸盐还原生化管，置于35℃恒温培养箱内厌氧培养。图4 生化反应鉴定  培养24h后，该菌生化反应结果为乳糖阳性（变黄）、麦芽糖阳性（变黄）、棉籽糖阳性（变黄）、甘露醇阳性（变黄）、山梨醇阴性（颜色不变）、硝酸盐还原阴性（加试剂不变色，加锌粒后变红），该结果符合丁酸梭菌的典型生化反应特征。三、注意事项  本培养基仅为细菌鉴定的一部分，需做其他补充试验。注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、简介：  在进行微生物试验时，菌种的挑选特别重要。除了要选对菌种外，还要注意对菌体生长状态的把握。  通常来说很多标准中都对试验用菌有要求，有的会明确要求用培养多长时间的菌进行后续试验，食品检验标准中经常可以看到这类描述，如“挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h，用于后续的确证试验。”“取生长旺盛的FTG培养液1 mL接种于含铁牛乳培养基……”（参考GB4789.13  食品微生物学检验  产气荚膜梭菌检验），而有些标准则不厌其烦地强调“新鲜培养物”，如《中国药典》中，在培养基灵敏度检查部分，就再三强调这一点，“菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30°C～35°C培养18h～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上”（参考《中国药典》 2020版  第157页）……二、试验说明  标准中之所以这么要求，是希望能用最优状态的菌种，做出最明显的效果，保证试验结果的可靠性。本文以平板上不同区域菌体的形态差别对此问题进行说明：分别将大肠埃希氏菌（典型的革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（典型的革兰氏阳性菌），在TSA平板上三区划线、培养，然后将每种菌分别从同一平板上的三个区域挑菌、涂片、镜检，观察它们的菌体形态，为了方便观察，涂片后先用结晶紫进行染色，再进行镜检观察。结果如下（图1、图3）：图1 大肠埃希氏菌在平板上三区划线培养后的菌落及菌体状态  大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，革兰氏阴性短杆菌，大小0.5微米~0.5×3微米。从镜检结果不难发现，同一平板上不同区域长出的菌体，形态差别非常明显：一区的菌体为短杆状甚至点状，有些菌体已经明显衰亡；二区杆状形态的菌体明显增多，且比一区的杆状菌体较长、较粗；三区菌体全部为较长的杆状且非常粗壮，与对数生长期菌体在扫描电镜下的状态基本一致（如图2）。图2 扫描电镜下对数生长期的大肠埃希氏菌形态金黄色葡萄球菌，作为一种典型的革兰氏阳性菌，三个区域内菌体差异虽然没有那么显著，但也呈现出同样的规律（如图3）。图3 金黄色葡萄球菌在平板上三区划线培养后的菌落及菌体状态三、讨论：  同一平板的不同区域的同一种菌呈现不同的形态，可以直观解释为一区菌体密度太大，二区次之，三区菌体密度较小所致。其根本原因在于，同等面积的区域上菌体密度过大，会造成菌体间营养竞争，有些菌体因为营养不良生长较差或长不出来，同时区域内的优势菌株还可能产生一些细胞毒素等，遏制其它菌体的生长。而三区内的菌营养比较充足，生长几乎不受影响，所以菌体状态最好。  我们做实验时，通常都会要求用生长状态最好的菌，有时候用新鲜菌体能做出很明显的阳性结果，但如果菌体不新鲜，就会形成假阴性结果（参考氧化酶试验的操作方法及注意要点）。  综上所述，在微生物试验过程中，无论制作菌液还是进行菌株鉴定等，一定要注意菌体的新鲜度和菌体的健壮程度，尽量选用新鲜健壮的菌体进行试验。如果是在平板上挑菌，我们通常挑取三区生长的单菌落进行后续试验。注本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 一、沙门氏菌简介：  《Bergey’s鉴定细菌学手册》第9版（1994）对沙门氏菌的描述为：沙门菌为G-直杆菌，大小(0.7-1.5)μm×(2.0-5.0)μm，菌落直径2mm-4mm。通常具有周鞭毛，能运动，兼性厌氧，最适培养温度37℃，发酵D-葡萄糖及其他糖类产酸，通常产气，氧化酶阴性，触酶阳性，靛基质和V-P试验阴性，甲基红（MR）试验及西蒙枸橼酸盐阳性，赖氨酸和鸟氨脱羧阳性，精氨酸双水解酶反应不定。产生H2S，不水解尿素，氰化钾培养基生长和利用丙二酸盐不定，能还原硝酸盐，通常发酵L-阿拉伯糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、L-鼠犁糖、D-山犁糖和D-木糖。  沙门氏菌属食物中毒是一种常见的细菌性食物中毒，原因主要是食品被沙门氏菌污染、繁殖，再加上处理不当，未能杀死沙门氏菌。在加工被污染的猪肉及内脏时，常因加热不够或切块太大，食品中心部分仍有存活的细菌，食后可致中毒。另外，在患病的牛乳中，如加热不彻底也可中毒。  沙门氏菌食物中毒主要有三种表现类型，即胃肠型、伤寒型、败血症型。以胃肠型最为常见。前期症状有寒战、头痛、头晕、恶心与痉挛性腹痛，继之出现呕吐、腹泻、全身酸痛或发热，每天腹泻可达7～8次，体温在38℃～40℃之间，病程约3～5天，一般2～3天腹泻停止，体温恢复正常，一般情况好转。严重者，特别是儿童，老年人和体弱者常因脱水、酸中毒、无尿、心力衰竭等，会因急救不及时而危及生命。  鉴于以上所述的沙门氏菌的危害性，所以在食品检验中，需非常重视沙门氏菌的检验。能否用最有效的方法，对样品中的沙门氏进行检出，尤其重要。但由于沙门氏菌种类繁多，按照考夫曼·怀特的分类，已确认的沙门氏菌属有2000多个血清型，根据沙门氏菌抗原结构的不同，可分为A、B、C、D、E等34个组，其中主要有猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠类沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸭沙门氏菌等10多个血清型。  如此庞杂的沙门氏菌家族，只用一种培养基进行增菌，很难将样品中所含的所有沙门氏菌一个不差地培养出来，所以很多标准规定采用两种培养基进行增菌。二、标准要求的培养基：  《GB4789.4 食品安全国家标准  食品微生物学检验  沙门氏菌检验》中规定对沙门氏菌的增菌采用四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）培养基。其检验流程如图1：图1  沙门氏菌检验程序三、培养基比较：  两种培养基的比较如表1表1 四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）培养基的比较  从表中可以明显看出，两种培养基除了一些基本的营养成分外，最大的区别就是抑菌剂的选择不同。TTB中选用了胆盐、硫代硫酸钠、四硫磺酸钠（四硫磺酸钠是在培养基加入碘液时形成）和煌绿作为抑菌剂，抑菌能力较强；而SC则选用了较单一的亚硒酸氢钠作为抑菌剂。  两者的差别还在于以下几点，使用时需要特别注意：  1、抑菌剂的添加方式不同，TTB中胆盐和硫代硫酸钠直接添加到干粉中，可进行高压灭菌，但碘液和煌绿则是配成溶液的形式，需要将基础灭菌后，使用前临时加入培养基中，不宜久置；而SC中的亚硒酸氢钠是直接加到干粉中去的，可以与其它成分一起进行灭菌。  2、两种培养基灭菌方式不同，TTB基础可高压灭菌，SC只能轻微煮沸（即刚开始沸腾就撤离加热源）的方式，且要迅速用凉水冷却，以免颜色发生变化，影响使用效果。  3、两种培养基的培养温度不同，TTB需要在42℃±1℃条件下进行培养，而SC需要在36℃±1℃条件培养。  4、不同种类的沙门氏菌在这两种培养基中的生长情况如图2图2  不同类型的沙门氏菌在TTB和SC培养基中的生长情况四、讨论：  经常有人问，为什么一定要用两种培养基进行增菌，这两种培养基增菌后的液体怎么划线，有没有什么选择取舍之类的做法？答案是否定的。首先，我们之所以选择两种培养基进行增菌，其目的就是为了将样品中的沙门氏菌尽量多地培养出来，关于接菌，标准（《GB4789.4 食品安全国家标准  食品微生物学检验  沙门氏菌检验》）中有明确描述：“轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18 h~24h。同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h~24h。”在这一过程中，两种培养基本来就是互相补充，既然已经培养出来，肯定是要都进行划线分离检验的。  也就是说，TTB增菌液分别在标准中列出的BS和XLD上划线，SC增菌液也要分别在BS和XLD上划线， 最后两种增菌液中划线检出的可疑菌株都要进行下一步检验。  同样的情况还有，有的标准中要求使用RV肉汤和SC培养基进行增菌，也要遵循这种做法，不能只选用一种增菌液进行划线。注：本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

1.LB琼脂：  此培养基为非选择性固体培养基，常用于分子生物学中大肠杆菌的培养，也可用于大肠杆菌活化和纯菌计数。可在培养基用加入对应的抗生素（如青霉素、四环素、卡那霉素等）进行特定转基因大肠杆菌的筛选。2.伊红美蓝琼脂（EMB）：  此培养基为弱选择性培养基，不仅适用于大肠杆菌的分离培养和计数，也适用于大肠菌群的分离培养。大肠杆菌由于强烈发酵乳糖产酸，菌落通常为紫黑色，带有绿色金属光泽（也有一些大肠杆菌菌落不带金属光泽），大肠菌群发酵乳糖产酸稍弱，菌落通常为红色或粉红色，无金属光泽，不发酵乳糖的其他肠道菌通常为无色或淡红色菌落。因分离效果较弱，此培养基更常用于大肠杆菌或大肠菌群多管发酵法中阳性管的确认。3.麦康凯琼脂：  检验分离肠道菌最常用的培养基，在药典中用于大肠杆菌的检测，在食品标准用于肠道致病菌的分离。培养基中较多的胆盐及结晶紫对大多数革兰氏阳性菌有很强的抑制效果，大肠杆菌由于强烈发酵乳糖产酸，在培养基上菌落为桃红色，并且菌落周围通常有明显的沉淀环，大肠菌群同样能发酵乳糖产酸，菌落也为桃红色，致病性的肠道菌则通常因不发酵乳糖（如志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌等）菌落呈无色。此培养基由于对大肠杆菌的专一性较弱（大肠菌群和大肠杆菌的菌落特征比较接近），若样品中大肠菌群的含量比较高，分离大肠杆菌的效果并不理想。4.大肠杆菌显色培养基/TBX培养基：  利用酶底物法原理，对于大肠杆菌的分离和计数有高度的特异性，大肠杆菌特有的β-葡萄糖醛酸苷酶可分解培养基中的底物，使菌落呈蓝绿色，而大肠菌群和其他大多数杂菌通常为无色或其他颜色，革兰氏阳性菌大多数不生长。特别是在干扰菌较多的情况下，显色培养基的分离率要远高于其他的培养基，缺点是价格较高，还有极少数大肠杆菌不产生β-葡萄糖醛酸苷酶，不能显色（如肠出血性大肠埃希氏菌O157菌）。此培养基适用范围较广，食品、水、环境等均可检测。5.哥伦比亚MUG培养基/MUG营养琼脂：  原理与显色培养基相同，大肠杆菌可利用β-葡萄糖醛酸苷酶特异性分解MUG，在紫外灯下产生荧光，特异性较强，极少数不产生β-葡萄糖醛酸苷酶的大肠杆菌不产荧光。但此培养基没有选择性，多数杂菌都能生长，因此通常只用于含菌量较少的水中大肠杆菌计数。6.VRBA-MUG培养基：  在VRBA基础上添加了MUG，相比较于哥伦比亚MUG培养基，VRBA-MUG培养基具有选择性，可抑制革兰氏阳性菌的生长，大肠杆菌和大肠菌群可在此培养基中生长呈紫红色菌落，周围有沉淀环，由于添加了MUG，在紫外灯下照射时，大肠杆菌菌落可有荧光反应，而大肠菌群则没有荧光。此培养基一般用于食品中大肠杆菌的检验和计数。LB琼脂（lennox）-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product2106.htm伊红美蓝琼脂(EMB)-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product9.htm麦康凯琼脂-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product334.htm大肠杆菌显色培养基-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product528.htmTBX培养基-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product532.htm哥伦比亚MUG培养基-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product481.htmMUG培养基-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product310.htm结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂(VRBA-MUG)-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product3535.htm注：本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、试验简介  氧化酶又名细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶c或呼吸酶。通过氧化酶试验可检测细菌是否能产生该酶，主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。二、试验原理  氧化酶为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素c氧化，然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，生成有颜色的化合物，从而表现为颜色反应。三、试剂  1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。四、试验方法  常用方法有以下几种：  （1）菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。具体操作为，取37℃培养20 h的斜面培养物一支，将2～3滴试剂从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可将试剂滴在菌落上。  （2）滤纸法：取一小块洁净滤纸，沾取少量菌，然后滴加试剂。  （3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，刮取菌苔涂于试剂纸上。  其操作手法如图1所示：图1  纸片法进行氧化酶试验的操作手法  （4）拭子法：拭子应浸入试剂中，然后与可疑的分离菌落接触，在10秒钟内注意颜色的变化。  （5）试管法：取18-24 h的营养肉汤（4.5mL）新鲜细菌培养物。加入试剂（0.2mL），摇动试管，以确保混合物充分混合，观察颜色变化。五、试验结果  细菌与试剂接触后，在10秒内呈深紫色，为强阳性；于2min内呈现蓝色者为阳性；阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均判为阴性结果。  为保证结果准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌作阳性和阴性对照。六、注意事项  （1）进行测试时，试剂可能会自动氧化，因此使用新鲜试剂至关重要。为保证试剂新鲜，从配制到使用不应超过一周。  （2）纯化菌时，要选择不含过多糖类的培养基，如营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂。培养基中高浓度的葡萄糖会导致假阳性结果。  （3）如果被测微生物在含有染料的培养基上生长，则结果可能会异常。  （4）在将试剂添加到活性培养物中之前，请先将培养物进行传代培养，因为某些试剂会杀死微生物。  （5）氧化酶测试有助于鉴定奈瑟菌以及鉴定和区分革兰氏阴性杆菌。为了确定被测生物的革兰氏反应和形态，应使用革兰氏染色进行检查。  （6）刮取菌苔一定要使用铂金环、一次性塑料接种环或玻璃棒。使用包含铁的环可能会导致假阳性结果。  （7）如果所用试剂或试剂条的敏感性较低，则可能会导致假阴性结果。  （8）试纸条上滴加无菌水时，以刚刚浸湿为宜。若加水太多，会影响反应效果，延长反应时间，或无颜色反应，造成假阴性（如图2）。左：10 uL              右：20 uL图2  不同用量的无菌水对氧化酶试验结果的影响  （9）确保用于氧化酶测试的菌落菌龄为18至24小时。较老的菌落，则会导致反应较弱甚至不反应（如图3）。左：24h菌苔            右：2周菌苔图3  不同菌龄的菌苔对氧化酶试验结果的影响注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。 

PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应。是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术的发展历史：  1985年关于PCR 的文章首次由美国科学家Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 。  1989年《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993年Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理：  遗传物质由细胞核、染色体、DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)、碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。   PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。  PCR反应的基本成分包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。基本反应步骤 ：变性--退火--延伸。最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出。PCR技术的注意事项：1、防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。2、引物设计合理。3、Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环。4、镁离子浓度对反应效率的影响。5、仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等。6、RT-PCR注意防止RNA降解。

一、温度  温度是影响微生物生长的一个重要原因。  温度对微生物的影响表现在：  1.影响酶活性。当温度升高时，细胞内化学和酶反应以较快的速率进行，生长速度加快；当温度降低时，细胞内化学和酶反应以较慢的速率进行，生长速度减慢。  2.影响细胞质膜的流动性。温度高流动性大，有利于物质运输；温度低流动性降低，原生质膜处于凝固状态，不能正常地进行营养物质的运输，不利于物质运输，因此温度变化影响着营养物质的吸收和代谢产物的分泌。  3.影响物质的溶解度。二、PH  PH影响微生物的生长，因为PH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。每一种微生物都有一个可生长的PH值范围，以及最适宜生长PH。大多数自然环境PH为5-9，适合多数微生物生长。只有少数微生物能够在低于PH2或大于PH10的环境中生长。根据微生物对PH的要求范围，可分为嗜酸性微生物、嗜中性微生物、嗜碱性微生物。三、氧  对于氧的需要，微生物有三种类型：好氧型、厌氧型、兼氧型。  1.好氧型：氧气是好氧型细菌的生活条件，也就是说没有氧气它们就不能存在。  2.厌氧型：氧气是厌氧型细菌的生活抑制物质，氧气对它们生活和生存形成抑制。  3.兼氧型：兼氧型细菌在有氧和缺氧的条件下都能正常生活，有氧的情况下通常生长的更好，物质能够得到充分的利用。四、营养物质的组成和浓度  培养基中的营养物质的浓度对微生物的生长也有很大的影响。在微生物培养基中，某种基本营养物质被耗尽也可使微生物的生长停止。即使培养基中没有任何毒物存在，但是其他营养物质仍很丰富，当添加少量这种营养物质时则微生物的生长可以重新开始。  注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。 

琼脂具有特殊的溶点和凝固点，所含成分很难被微生物分解利用且不含抑制性成分，因此很适用于微生物培养基的制备，从而作为固体培养基最常用的凝固剂，到目前为止，在这方面世界上还没有一种能够完全替代琼脂的代用品。  一些初期从事植物组织培养工作或微生物培养的人员，尤其是初学者，在配制培养基时往往会遇到培养基难以正常凝固的现象：或呈半流体、或完全呈液体状态、同时还会现出各种颜色。本文将对琼脂的凝固性以及影响其凝固性的关键因素作系统的介绍，并针对不同的操作方法进行问答式评价，以期能帮助更多的人解决实际工作中的相关问题，少走弯路。一、有关琼脂的知识  琼脂，又名琼胶或冻粉，因最初从日本海藻中提取，故又称“洋菜”。琼脂成品为白色或淡黄色粉末状或细条形，主要是由复杂的大分子多糖类物质组成。其水解物的组成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸，实际上，它是琼脂胶和琼脂糖两种成分的混合物。琼脂胶是琼脂糖的硫酸酯，琼脂糖主要依靠氢键的引力形成网状结构。因此，琼脂糖凝胶的稳定性比那些以化学键交联而形成网状结构的凝固剂的稳定性要差一些。  琼脂溶于热水而不溶于冷水，因此在配制培养基时需煮制琼脂。随着温度的升高，琼脂逐渐溶解，当温度下降到40℃时则开始凝固。配制培养基时应注意，由于各地生产的琼脂的质量不同，同样浓度的琼脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色泽上会有所差异。劣质琼脂不仅凝固性差，而且带有很多杂质。二、有关琼脂凝固性的知识  作为培养基的凝固剂，琼脂的凝固性除与琼脂本身的品质有关外，还会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和pH值的影响。  （1）0.7%～0.8%的琼脂水溶液在冷却后会很好凝固，对于常用的微生物培养基，琼脂的用量基本趋于稳定，通常条状琼脂的用量约为2%，粉状琼脂的用量为1%～1.5%。  （2）培养基的酸碱度对琼脂的凝固性影响很大，是琼脂在正常浓度范围内能否凝固的关键因素，当4.30  （3）在4.302，120℃)的影响很小，延长高温高压灭菌时间或反复高温高压处理均不会影响其凝固性。pH较高(5.0-8.0)时，琼脂浓度是影响凝固等级的主要因素。  （4）当配制的固体培养基pH低于3.44时，其凝固性会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和pH值的影响。其中灭菌温度、灭菌时间与琼脂凝固性呈负相关，琼脂量、pH值与琼脂凝固性呈正相关。但在这些因素中，琼脂量的影响不是很大，因此在该类培养基的灭菌过程中应该重点把握好灭菌温度、灭菌时间和pH值。使用较低的灭菌温度，较短的灭菌时间，适当地增加培养基的pH值就可以显著提高琼脂的凝固性。pH较低(≤4.0)时，pH是影响凝固等级的主要因素。三、案例分析  基于实验得出的理论知识，大家都比较好理解和接受，但在实际操作过程中，经常会有人碰到琼脂不能凝固的情况（如图1），下面针对具体案例进行分析讨论：图1 灭菌后的培养基出现分层现象案例一  问：我使用的是**生产的琼脂，用冷水就能溶解了，高压蒸汽灭菌后就能使用了，最近在倒平板时，发现有几块怎么也不凝固，同一瓶子里的琼脂只有几块不凝固，我专门放到第2天发现还是稀呼呼的。  答：首先纠正一下，您说用冷水就能溶解了，这肯定不对：琼脂溶于热水而不溶于冷水，将琼脂放在冷水中，充其量只能是把琼脂浸湿了泡软了，根本达不到溶解的程度，也就谈不上均匀地分散在培养基溶液中了。既然分散不均匀，灭菌后倒出的平板，就容易产生琼脂含量不一的结果，表现出来的现象就是您所描述的，同一瓶子里的琼脂，有几块怎么也不凝固，即使放到第2天或更多天，也不会凝固，因为里面的琼脂含量很少啊，达不到凝固的要求，即使放再多时间结果也是一样。  问：必须要完全煮化吗？  答：琼脂必须煮沸，常温下是溶解不了的，只有煮沸后再冷却才会凝固。  问：夏天温度高的时候是不是就不用煮沸了？  答：配好培养基后，一定要加热搅拌溶解。培养基外包装标签上说得很清楚，要加热煮沸至完全溶解，夏天温度再高也不会超过50度吧？所以天气热了也要这么做，使得培养基中各成分混合均匀。步骤不要省略！！！  问：那我们以前都是同样的操作，怎么都好着呢？  答：正确的培养基配制方法应该是先将含琼脂培养基煮沸至完全溶解之后，再分装入三角瓶中进行灭菌，并且灭菌完毕从锅里拿出来后，要及时摇一摇三角瓶（用力摇），使灭菌后的培养基中琼脂能够均匀分散在里面，然后再倾倒平皿。你之前没出问题，不代表你的操作就是合乎要求的，你不按照正规的方法操作，迟早会出问题的，这不就被你碰到了吗？  另外，即使灭菌前没有先煮沸再分装灭菌，只在灭菌完毕，开锅后第一时间将瓶内培养基摇匀，也就不会出现你碰到的问题了。  这里需要注意，摇匀，一定是用力摇匀，而不是随手轻轻一晃就行了。  问：为何还要摇啊？你在煮沸、灭菌时，不就自然匀了吗？  答：灭菌时能自然匀了？这也是你自己认为的吧？当然很多人都会这么认为。熬粥的时候满锅里都沸腾，稍放置一会儿，锅底的粥是不是要稠一些？大同小异！  问：可是灭菌后摇晃容易产生气泡啊？  答：开锅拿出来后手摇几下就匀了，少量气泡稍微静置就会消掉的，或者放到水浴锅里恒温到50度的时候一般就没有气泡了。临倒平板前就不要摇了！那时候再摇，气泡可能就不容易消掉了。  问：那我怎么摇匀？我用500mL的三角瓶配500mL培养基，根本摇不起来！  答：问题就出来这里，做微生物实验，将配好的培养基分装到适当容器中，培养基体积不应超过容器容积的2/3(可参考GB 4789.28食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求)。也就是说不要将瓶子里装得满满当当的，这样很容易导致琼脂沉在下面，不容易摇匀。  我们平时做实验，配500mL培养基用1000mL的瓶子，配200mL培养基用500mL瓶子，500mL的瓶子里最多装400mL培养基的，你比较看看你的装量。  问：我们一直都这么配制的，只是最近的出了问题，同一瓶培养基，只有几个板这样的。  答：培养基的标签上有明确的用法：称23.5 g于1 L蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，121摄氏度灭菌15分钟，冷却至46摄氏度左右备用。  对比上面的解答，看看你们一直以来的操作有哪些问题吧，然后按照正规的操作要求再坚持一段时间，再出现同样的问题再来找我好吧？(不摇匀的情况下，同一瓶培养基倒出的平板强度差异很大，可参考附录表格)。案例二  问：配制的是营养琼脂培养基，都是按照上面说的配制的，灭菌后放入冰箱怎么也不能完全凝固，在底部还有非常硬的像胶皮一样的胨。请帮忙看看到底是怎么回事。  答：有没有想过最底部的非常硬的胶皮一样的东西是什么？那就是相对很浓的琼脂液冷却形成的。如果把这一部分琼脂趁热摇匀，使其均匀分散在整瓶培养基里面呢？是不是上面就没那么稀了，能凝固了，下面也没那么稠了，硬度合适了。也就是说摇匀后倒平皿，整瓶培养基都能用了。  你灭菌后没经过摇匀，琼脂本来就沉积在瓶底，直接放入冰箱，瓶底迅速冷却，大量的琼脂就先凝固了，瓶子上面的部分含琼脂就很少了，所以才会不凝固。不管放多久都不会改善啊！  问：听说琼脂太酸也不会凝固，是不是我们使用的培养基pH不合格啊？  答：pH合格不合格，你测一下不就知道了。在pH 5-10之间，pH对琼脂的凝固性影响并没有那么大。你用的都是常规培养基，pH怎么可能那么低嘛。另外，如果是pH值太低的话，加热以后琼脂会变性，底部就不会有凝固的琼脂硬块了，而会成一瓶糊糊。你这显然是琼脂混合不均匀引起的，使用前用微波溶化，晃一晃就好了。  问：用两个大烧杯把融化了的培养基来回倾倒混匀，然后倒皿，效果不错。  答：道理是一样的，就是为了使琼脂混合均匀。但这种操作方法有点繁琐，并且容易染菌，不提倡。  问：像我这种情况，培养基还能用吗？  答：能用！重新水浴加热，让其完全溶解后，摇匀，倾倒平板即可。或者用微波加热，要注意随时观察，经常拿出来摇一摇，以免培养基喷出。  问：培养基可以多次这样反复融化使用吗？  答：不建议！如果不是不得已，建议现灭现用。案例三  问：今天分别用了伊红美蓝琼脂和营养琼脂两种培养基做斜面，然而灭菌后做斜面都不凝固，这是为啥？有的凝固也就是一半凝。  我的步骤：如营养琼脂，按配比称3.3g加100mL水，加热搅拌溶解，分装到试管中后加棉花塞，包扎后于121℃灭菌锅中灭菌20分钟，好了之后制作斜面，等了有半小时久，培养基都不凝固这是为何？  答：你先要煮沸溶解培养基，搅拌均匀，稍冷后（50℃）尽快分装，琼脂的在水中需加热至95℃时才开始熔化，你只是加热搅拌溶解，琼脂是不是真正溶解透了有待考证。  试管灭菌完毕，拿出来晃一晃再摆斜面，否则容易上层稀不凝固，下层浓很容易凝固。跟三角瓶灭培养基是一样的道理。  问：我煮了还是没很凝固这是为什么？  答：先加热煮沸，直至白色泡沫上升，然后再分装、高温高压灭菌。  问：白色泡沫上升好危险，我试过被琼脂沸腾连塞子喷我一脸！  答：我们通常都是用搪瓷缸，最多装液量1/3，煮沸三次，彻底煮透、溶透。  问：溶解后用吸量管分装，在吸量管中就凝固了，要怎么分装？量筒吗？  答：我们都是用10 mL或5 mL移液枪分装的，再把分装试管塞好灭菌。  煮沸溶解分装然后灭菌制斜面成功了！再次提醒，灭菌后，温度没降下来前一定要摇一摇，不管瓶装还是试管装，都要摇匀！！案例四  问：琼脂培养基制作斜面为什么无法完全凝固，而做培养皿时完全凝固？  答：琼脂混合不均匀。相比三角瓶，试管的空间更加狭小，开锅后一定要趁热晃一晃，使底部沉积的琼脂完全混匀。否则就容易导致试管底部凝固，而上部不凝固或凝固不好的问题。案例五  问：微生物检验用的营养琼脂培养基，可以第二次高压灭菌么?有何影响，如果加热培养基使其溶化后，不一会儿就会凝，而如果用高压灭菌就不会很快凝固，所以想再用高压湿热灭菌，加热使其溶化，可否?  答：二次高压湿热灭菌，会导致营养成分的损失。所以，最好是通过水浴加热，温度维持在100度，琼脂就可完全化开，冷却至50度左右，就可进行倒板等操作了。  问：培养基能加热几次?营养琼脂和玫瑰红钠配置好了以后，我是保藏在冰箱里的，同一瓶最多能水浴几次使用呢?  答：在保证不染菌的情况下是可以多次使用的。琼脂的溶解温度是95度，若水浴的话时间来得及可以是沸水浴。若是时间紧迫可直接放在电炉上熔化，但要一直盯着，防止沸出来。如果是已经灭好菌的玻璃器皿，可以用微波炉加热，不过要注意观察，防止沸腾出来。一般从冰箱里拿出来就用一次，不提倡反复融化。  问：有人说加热时间过长，也会导致琼脂不凝固，是这样吗？  答：是的。通常来说，灭完菌就要及时开锅取出培养基。如果因为其他原因，耽误了，稍有延长也不大要紧，这里所说的加热时间过长，是指高压超过半小时或者灭菌后一直放在灭菌锅内很长时间甚至过夜的情况。这些都是错误的操作，即使培养基能凝固，里面的营养成分也发生了很大的变化，对实验结果的判断造成很大影响。应该杜绝类似的操作。  通过上述几个案例的分析，我们可以总结一下。遇到固体培养基不凝固的情况，通常首先考虑一下几点：  （1）琼脂少，特别是自己配制培养基时，可能根本就漏加琼脂了；  （2）pH值不对，实验室用水PH过低，且配制完没能调整pH，或者本身就是酸度很大的培养基；  （3）反复加热；  （4）加热时间过长；  （5）灭菌前是否煮沸溶透，灭菌后是否摇匀。  结合自己的实际操作，一项一项排除查找原因。这里面，最简单也最容易被忽视的就是灭菌后摇匀的问题。  本实验室试验对比发现，倾倒平皿前摇匀与不摇匀，所形成的平板强度差异很大，如果不经摇匀直接倾倒，形成的平板有约有2/3凝胶强度过低，不能满足试验要求，而最后倒出的几块平板强度会急剧升高，硬度过大，也影响使用；而摇匀后再倾注的平板，凝胶强度数值分布比较均匀，满足试验要求（表1，图2）。经常听到有人说，平常一直那么做（不煮沸，不摇匀），都没问题，实际上那样倒出来的平板只是都凝固了而已，即使能用，平板间凝胶强度的差异也是很大的。  希望大家在实际操作中一定注意，严格按照说明书的要求进行操作。附图表：表1 用相同方法配制的等量培养基开锅后摇匀与不摇匀倾倒成的平板强度图2 倾倒平板前培养基摇匀和不摇匀所倾注的平板强度规律 注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、弧菌简介  弧菌是一种可以在温带水环境下发现的细菌属。他们通常具有共同的特征和习性。如：  （1）革兰氏阴性，短小弯曲弧状，无芽孢，多数有鞭毛、菌毛（如图1）；  （2）具有一端单生鞭毛，运动迅速；  （3）多数菌株生长需要2%-3%氯化钠；  （4）最适生长温度为30℃-37℃；  （5）对热敏感，90℃ 1min即可杀死，50℃ 20min或65℃ 5min也可达到杀菌效果；  （6）耐碱怕酸，1%醋酸或50%食醋中1min死亡。图1 弧菌的显微形态二、样品处理规定  对于可能含有弧菌的样品的保存和检验，各相关标准均作了规定：  （1）非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验（GB4789.7-2013 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验）；  （2）新鲜样品采集后应于3h内完成检验，若不能在规定时间内完成，则应将样品置于7℃～10℃条件下保存，并尽可能在24h内完成检验（GB4789.44-2020食品微生物学检验 创伤弧菌检验）；  （3）样品采集后应立即在7℃～10℃保存，24h内检验。如果样品需要冷冻，于-18℃保存，24h内检验。为了最大限度地保证弧菌的存活率，应避免样品与冰直接接触（SN/T 1022-2001 进出口食品中霍乱弧菌检验方法）。  通常来说，样品保存需放在4℃条件下，但弧菌检验标准中，对样品的保存条件，均要求7℃～10℃，特意避开了4℃，这是因为创伤弧菌在4℃条件下极易形成活而不可培养的状态（参考GB4789.44-2020 食品微生物学检验 创伤弧菌检验）。三、保存温度  基于弧菌对温度的敏感性，实验室在保存弧菌的标准菌株的时候，也要注意温度条件。对于储备菌株，有条件的可以保存在-70℃超低温冰箱中，一般室温指25℃左右，因为白天晚上会有温差，除非有温控设备，否则没办法保证一般环境温度在25℃-28℃之间，其实只要温度不是太高，放在室内环境中短期内是没有问题的。对于真空冷冻干燥的菌株，未开封状态下于-20℃冰箱中至少可以保存2年。  对于工作菌株，本实验室在长期工作实践中发现，由于冬天室温偏低（不高于10℃），也不利于弧菌的保存。一周内所划平板，尽管也有尚存活的弧菌，但其活力已远不能满足试验可靠性需要，因此为能保证每次试验的可靠性，建议每次接菌都用前一天在3%NaCl TSA平板上划线培养所得的新鲜菌落；为保证试验的连续性，在试验阶段应该每天划平板培养；培养好的平板，用完后直接放回培养箱，当天下午下班前拿出灭菌丢弃。  务必记住，弧菌液体试管和划线后的平板，一定不能放置在4℃冰箱中。四、纯化培养与菌悬液制备  因为多数弧菌具有嗜盐性，而在无盐的环境中生长不好甚至不生长，因此在培养该菌时，通常需要加入2%-3%的NaCl，而在初步筛选出该菌后进行纯化时，各标准都要求用含3%NaCl的营养琼脂进行纯化，也是基于这个原因。  为方便副溶血性弧菌的鉴定，我公司开发出了副溶血性弧菌鉴定条和嗜盐试验系列生化管（编号分别为HBIS02、GS014、GS015、SN052、GS016），在使用这些产品时，需要挑取纯化的菌落做成菌悬液，再往管中滴加，此时需要注意，务必使用0.85%生理盐水进行菌悬液的制备，而不能用无菌纯净水，并且制成菌悬液后要尽快滴加完毕，否则会影响结果的判定。  试验证明，用生理盐水制备的菌液，放置1h后菌数降低至初始状态的50%左右；而用纯水制备的菌液，放置1小时几乎无活菌。即使稀释后立即涂布，纯水悬液中的菌数也会迅速降至生理盐水稀释液中菌数的10%以下（如图2）。 图2 副溶血性弧菌ATCC 17802用纯水和生理盐水稀释后放置不同时间后的菌数  综上所述，为保证菌种的存活，弧菌菌种应在-70℃超低温保存或室温，一定不能放在4℃环境保存；为保证试验结果的准确性，弧菌鉴定试验中，应该尽量用新鲜的菌板，挑单菌落至无菌生理盐水制成菌液，制成的菌液不宜搁置时间太长，必要时需要重新制备。注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、培养基简介：  硫乙醇酸盐流体培养基，也称液体硫乙醇酸盐培养基（FT），是在有氧条件下培养厌氧菌的一种澄清液体培养基。  《中国药典》中列出该培养基的配方为：培养基配方中各成分的作用及原理，可参考  本文主要就《中国药典》中对该培养基的质量和使用方法上的一些规定进行分析和解读。二、关于使用范围的规定：  《中国药典》规定：硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。  顾名思义，对于厌氧菌的培养，必须使用硫乙醇酸盐流体培养基，而对于需氧菌，则有两种培养基可选用，硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，本人认为，对于需氧菌应首选胰酪大豆胨液体培养基，因为硫乙醇酸盐培养基因为空间有限，里面的氧浓度未必能满足所有需氧菌的生长。尤其是药品中有些需氧菌可能菌体细胞已经受损，在这种氧气浓度受限的培养基中未必能准确检出；另外，培养基中刃天青的存在，也会对细菌的生长有抑制。综合这两方面考虑，为了将药品中的需氧菌尽可能检出来，建议最好使用胰酪大豆胨液体培养基。三、关于氧化层的规定：  《中国药典》规定：该培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。  即分装硫乙醇酸盐培养基所用的容器必须有一定的高度，最终目的是为了能够更好地营造培养基内部的厌氧环境。目前我公司产品有多种规格，干粉形态、即用型瓶装和即用型试管装。其中瓶装又分别有100mL、200mL和500mL规格，管装有10mL和7.5mL规格，满足不同客户群的需求（如图1）。图1 公司现有的硫乙醇酸盐流体培养基产品  对于氧化层的高度，2020版《中国药典》还有如下规定：在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3（2015版药典中该项规定为1/5），否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。  正常生产出的硫乙醇酸盐是有氧化层的，这是有该款培养基的配方特性所决定，并不妨碍试验人员使用，只要氧化层满足相关规定，就能有效地检出样品中的厌氧菌。  生孢梭菌和产气荚膜梭菌在本公司产品中的生长形态如图2所示。图2 液体硫乙醇培养基中厌氧菌的生长状态四、有关培养基存放和培养温度的规定：  制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2-5℃避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。  除另有规定外，接菌后的硫乙醇酸盐流体培养基置30-35℃培养。五、有关对菌种的要求：  对于培养基灵敏度的检查，《中国药典》规定菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，以保证试验菌株的生物学特性。注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。 

一、原理介绍  酵母菌属真核生物，与细菌相比，酵母菌具有更完整的呼吸系统，可将糖类（包括糖、醇、苷、甙等）彻底氧化分解为二氧化碳和水，而细菌通常只能将糖类分解为低分子的有机酸等产物。因此，细菌的糖发酵试验常用酸碱指示剂通过颜色的变化检测某种糖是否能够被细菌分解利用，而酵母菌则可以通过杜氏管观察是否产气，来判断酵母菌是否能分解利用某种糖。二、培养基的配制及接种  （1）基础培养基（0.5%酵母液）：称取0.5g酵母浸粉，加热溶解于100mL纯化水中，分装至含导管的试管中，每支7.2mL（分装量依试管尺寸而定，120mm试管可分装3.6mL），115℃灭菌30min或121℃灭菌15min；  （2）糖溶液：单糖（如葡萄糖、半乳糖等）或双糖（如蔗糖、乳糖等）用纯化水配制成20%溶液，三糖（如棉子糖）用纯化水配制成40%溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。  （3）将过滤除菌的糖溶液0.8mL加入至灭菌后的含7.2mL基础液的试管中（糖溶液：基础液=1:9即可），混合均匀，并排掉导管内气体；  （4）挑取活化好的待测菌株至生理盐水中制成约106-108CFU/mL的菌悬液，吸取0.1mL菌悬液加入至糖发酵试管中，或用接种环（针）挑取菌苔直接接种至糖发酵试管中，25℃培养14天，逐日观察倒管内是否有气体产生。三、试验现象及解释  a、b分别为白色念珠菌和酿酒酵母菌的葡萄糖发酵试验，倒管内充满气体，即为葡萄糖发酵阳性反应；c、d分别为白色念珠菌和酵母菌的乳糖发酵试验，倒管内无气体产生，即为乳糖发酵阴性反应。  注：强阳性反应通常会在数天内观察到气体迅速充满倒管；迟缓阳性反应通常要培养7-14天可观察到气体充满倒管；若培养14天后倒管内仅有少量气体，则为弱阳性反应；14天后若导管内无气体，则为阴性反应。注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、称量错误  天平称量不准确、计算称量错误导致配制培养基的浓度不正确，都有可能导致出现部分沉淀。二、培养基PH值不正确  偏酸或偏碱的pH都有可能使培养基中的部分金属离子产生沉淀。三、水质不佳  多数培养基的制备需要使用纯化水、去离子水配制，而天然水中含有含有较多的矿物盐离子，若错误的使用了自来水，矿泉水配制，或使用的纯化水离子未除净，都有可能导致培养基灭菌后出现浑浊现象或沉淀（磷酸盐含量高的培养基更易出现此类问题）。四、灭菌方式不正确或灭菌过度  含有不耐热成分的培养基，若灭菌过度或加热过度，都有可能导致灭菌后的培养基颜色不正确或出现沉淀。如亚硒酸氢钠胱氨酸增菌液（SC），正常制备好的培养基应为淡黄色透明液体，澄清无沉淀，若加热过度则培养基中亚硒酸氢钠分解，最终制备的培养基会出现红色沉淀。五、容器不干净  新开封的容器或容器清洗不干净，内壁留有杂质，都会导致灭菌后的培养基中有杂质出现。六、溶解不充分  培养基灭菌前应充分搅拌热至完全溶解，方可进行灭菌。若灭菌前未将培养基溶解完全就进行灭菌处理，灭菌后易出现絮状或团块状沉淀，如Fraser培养基含有大量磷酸盐，若灭菌前未进行充分溶解，灭菌过程中磷酸盐易结成块灭菌后不溶解。七、培养基本身就有沉淀  培养基配方中无机盐成分较多或培养基本身含有不溶性成分，灭菌后会有沉淀存在，此为正常现象，不影响使用。例如MC、TTB、BS等，配方中含有不溶物，灭菌后有沉淀。八、添加剂加入时温度不正确  卵黄、血液等对温度敏感的添加成分，若加入时温度过高或温差过大，易出现凝块或絮状沉淀。注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。 

在细菌的生化反应试验中，我们都知道阳性反应用“+”表示，阴性反应用“-”表示，但在实际生化试验中，即使是同一菌属的不同菌株，同样的反应也会有差别，除了用“+”“-”表示阳性和阴性外，还引入了其他一些符号做为生化反应的扩充说明，标准或文献的生化表格下方通常也会附带有符号的说明。  “+”：  常规的阳性反应表示方式，但需注意，“+”也并不代表一定是阳性反应，在细菌生化鉴定手册中通常会有说明，“+”一般代表的是99%以上（或90%以上）的菌株为阳性反应（即仍然有＜1%的可能性遇到阴性反应的突变菌株或稀有菌株）。  “-”：  与“+”相反，常规的阴性反应表示方式，一般代表99%以上（或90%以上）的菌株为阴性反应。  “⊕”：  通常代表糖发酵试验阳性，产酸产气。如金黄色葡萄球菌可发酵乳糖产酸但不产气，用“+”表示，大肠杆菌可发酵乳糖产酸产气，可用“⊕”表示进行区分。  “（+）”：  多数情况下代表迟缓阳性反应，与“+”有所不同，例如大肠杆菌的乳糖发酵反应通常为“+”，做生化反应测试在18-24h内即可观察到阳性结果，而宋内志贺氏菌的乳糖发酵反应通常为“（+）”，出现阳性结果的反应比较慢，做生化反应测试通常需要延长培养3-7天才可观察到阳性结果。也有些标准或文献中用“（+）”代表大多数菌株反应为阳性（如GB4789.40-2016克罗诺杆菌检验标准中，用（+）代表90%-99%菌株为阳性，用（-）代表90%-99%菌株为阴性）。  “（-）”：  通常代表90%以上（或80%-90%）的菌株为阴性反应。  “w+”：  弱阳性反应，阳性反应结果通常不明显，介于阳性与阴性之间。  “+/-”：  阳性阴性反应均有，阳性反应菌株多于阴性（即通常指50%-89%的菌株为阳性反应）。  “-/+”：  与“+/-”相反，阴性反应菌株多于阳性。  “d”：  不同的菌株有不同的反应，通常指11%-89%菌株反应为阳性（相当于综合了“+/-”和“-/+”两种情况）。  “V”：  菌株间不稳定的反应，与“d”不同，“d”中不同种群或菌株的阴阳性反应虽然不同，但单一种群或菌株的阴阳性反应通常固定的，而“V”则是可变的，表示即使是单一种群或菌株也会出现可阴可阳的反应。  “NT”和“ND”：  通常表示未测定。  “NG”：  通常表示不生长。 

  1.以无菌操作方式开启冻干菌种管，加入适量培养液（按菌种选择培养液，如细菌选择营养肉汤、白色念珠菌选择沙堡液体培养基、分枝杆菌选择苏通综合液体培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏营养肉汤培养基），吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL相应培养液的试管，滴入少许菌种悬液，在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、黑曲霉菌为30 ℃±1℃培养42 h～48 h），此为第1代培养物。  2.用接种环取第1代培养物，或从菌种冻存管中取适量菌液/瓷珠，划线接种于相应培养基平板（按菌种选择培养基，如细菌选择营养琼脂培养基、白色念珠菌选择沙堡琼脂培养基、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、分枝杆菌36 ℃±1℃培养72 h、黑曲霉菌30 ℃±1 ℃培养42 h～48 h），此为第2代培养物。  3.挑取第2代培养物中典型菌落，接种于相应培养基斜面或平板（按菌种选择培养基斜面，如细菌选择营养琼脂斜面、白色念珠菌选择沙堡琼脂斜面、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂斜面、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基平板），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、分枝杆菌36 ℃±1 ℃培养72 h、黑曲霉菌30 ℃±1 ℃培养42 h～48 h），此为第3代培养物。  4.取第3代培养物，接种于相应培养基斜面，在适宜温度下培养至规定时间，此为第4代培养物。5.1.5 按上述方法培养至所需代数，传代时在试管上注明菌种名称、菌种号、代数及传代日期等基本信息。  本文节选自中华人民共和国卫生行业标准《WS/T 683—2020消毒试验用微生物要求》 

 培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物的试验结果，而pH值又是培养基的重要监控项目。这是因为微生物的生长不仅依赖丰富的营养，还需要一个适宜的pH环境，只有在适宜的pH环境下微生物才能正常生长繁殖或体现其生物特性，因此培养基pH值是否符合要求直接影响微生物检验结果。在培养基配制过程中，灭菌过程对培养基pH值影响尤为重要。我们常常可以发现，培养基在灭菌前后pH值有差异，一般灭菌后pH值都会有所下降，这是为什么呢？本文我们将和大家简单聊一下灭菌前后pH值变化的那些事。一、灭菌的时间和温度  在高压湿热灭菌时，长时间的高温会对培养基产生很多不利的影响，例如会导致营养物质分解、营养成分改变以及pH值变化，进而影响微生物生长。同时还可能引起培养基颜色变化、透明度降低、琼脂凝胶强度变化等。培养基在灭菌过程中，灭菌的温度和时间，高压灭菌器升温、降温的速率，灭菌容器的容积和装载方式等因素都对培养基的灭菌有着重要影响。二、培养基的成分  在培养基的配制过程中我们会发现，同样的灭菌温度和时间，同样的体积和装量的不同培养基，在灭菌后pH值变化不同，有的培养基pH值变化较多，有的培养基pH值变化较少。这是因为不同培养基的成分不尽相同，而不同的成分在灭菌过程中对培养基ph值有着不同的影响。糖类和蛋白胨是培养基中最常见的两种重要成分，那么这两种成分分别对培养基灭菌后pH值有着什么样的影响呢？  糖类，例如葡萄糖、乳糖等作为碳源被微生物所利用。糖类在高温条件下会产生有机酸使培养基pH值下降。一般情况下，培养基含糖量越高，灭菌后pH值下降越多。如果过度灭菌pH值变化会更加明显。同时，糖类在高温灭菌时容易焦化，使培养基颜色加深。  蛋白胨一般作为培养基氮源，为微生物的生长提供营养物质。蛋白胨在培养基灭菌时还能对培养基的pH值变化起到一定的缓冲作用。一般含胨量高的培养基，灭菌前后pH值变化相对较小。  另外，若培养基成分中含有缓冲剂，如磷酸氢二钾等，也可以减少培养基灭菌前后pH值的变化。三、测量pH值时的温度  同一培养基在不同温度下测得的pH值也会有一定差异，一般培养基的pH值会随着测量时温度的升高而降低。培养基灭菌之后未完全冷却时，测量的pH值一般会偏低，这是由于温度升高时溶液中的游离离子数增多，测得的pH值较低；反之，当温度降低时游离离子数减少，测得的pH值较高。通常我们在测定培养基pH值时，温度控制在25℃左右。  本文转载自微信公众号北京三药。 

1   方法来源1.1  进出口食品中霍乱弧菌检测方法(SN/T 1022-2010)1.2  卫生部《霍乱防治手册》第六版(2013年)2   适用范围   本程序规定了食品中霍乱弧菌（Vibrio cholera）的检验方法。本程序适用于食品中霍乱弧菌的检验。3   设备和材料   除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1  恒温培养箱：36℃±1 ℃。3.2  恒温培养箱：41.5℃±1℃。3.3  冰箱：2℃～5℃。3.4  恒温水浴箱：36℃±1℃。3.5  均质器或无菌乳钵。3.6  天平：感量0.1 g。3.7  无菌试管：18 mm×180mm、15mm×100mm。3.8  无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。3.9  无菌锥形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。3.10 无菌培养皿：直径90mm。3.11 微生物生化鉴定系统。3.12 无菌手术剪、镊子。4  培养基和试剂4.1 碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。4.2 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。4.3 4号琼脂：见附录A中A.3。4.4 庆大霉素琼脂：见附录A中A.4。4.5 商品化生化鉴定试剂：见附录A中A.5。5  检验程序6.  操作步骤6.1  样品处理称取25g样品放入盛有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL碱性蛋白胨水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500mL的灭菌容器内，加225mL碱性蛋白胨水，并充分振荡。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15 min,或2 ℃～5℃不超过18h解冻。6.2  一次增菌将深冻样品、干品、腌渍产品于36℃±1℃培养6h～8h，新鲜样品41.5℃±1℃培养6h～8h（如无明显的细菌生长现象则继续培养，但不能超过20 h）。6.3  二次增菌同时吸取上述一次增菌的表层增菌液0.2mL，加入10mL碱性蛋白胨水管中，36℃±1℃培养6 h～8 h。6.4  分离6.4.1 在所有显示生长的一、二次增菌管中用接种环沾取一环表层增菌液，分别于TCBS（或科玛嘉弧菌显色培养基）平板、4号琼脂（或庆大霉素琼脂）平板上划线分离。于36℃±1℃培养18 h～24 h。6.4.2 各种平板上霍乱弧菌的典型菌落特征见表1。6.4.3 纯培养每个平板上各挑取5个或以上可疑菌落（少于5个全部挑取），接种于营养琼脂斜面（或平板），36℃±1℃培养18h～24h。6.5  初步鉴定6.5.1 氧化酶试验挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，霍乱弧菌为阳性。6.5.2 粘丝试验挑选纯培养的单个菌落进行粘丝试验，霍乱弧菌为阳性。6.5.3 涂片镜检将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。霍乱弧菌为革兰氏阴性，呈弧形、逗点状等多形态，无芽胞。6.5.4 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24 h观察结果。霍乱弧菌在三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。6.6  确定鉴定初步鉴定结果相符者用微生物生化鉴定系统或商品化生化鉴定试剂进行系统鉴定。6.7  血清鉴定分型6.7.1 血清鉴定自营养琼脂斜面上挑取纯培养物与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。玻片凝集用血清的效价一般应为1：40～1：50。如可疑菌落在血清中很快（一般在10 s内）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均不凝集方可报告未检出O1群及O139群霍乱弧菌。6.7.2 O1群霍乱弧菌血清分型上述确定为O1群霍乱弧菌的培养物，分别使用小川型及稻叶型单价血清做玻片凝集，同时做生理盐水对照。6.8  报告当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求，同时与霍乱弧菌诊断血清凝集（生理盐水不凝集），报告25g（mL）样品中检出霍乱弧菌。霍乱弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。7.  毒力基因检测如鉴定结果为霍乱弧菌，需进行ctxAB基因的检测。注意：也可采用经过验证的商品化试剂盒。7.1  DNA模板的制备取适量纯培养菌落加入500μL灭菌dH2O中混匀，煮沸10min，15000×g离心3 min。取上清液储存在-20℃直至使用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒，按其说明提取制备DNA模板。7.2  PCR扩增7.2.1 引物可使用引物对5'-ATT TTG AGG TGT TCC ATG TG-3'和5'-ATA AAGCAGTCA GGT GGT CT-3'。扩增产物全长749bp。7.2.2 阴、阳性对照设置阴性对照(空白对照)以灭菌水作为PCR反应的模板；阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）作为PCR反应的模板。7.2.3 PCR扩增反应体系7.2.4 PCR反应程序               7.2.5 电泳用0.5.5c序制备1.5％的琼脂糖凝胶（含EB或Goldview 0.5μg /mL）。取5μL产物点样（可包括适量上样缓冲液），用DNA分子量标记物做参照，电压100 V，电泳50 min（根据实验室仪器情况确定具体电泳条件）。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。7.3  结果判定阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品出现749 bp大小的扩增条带，则可判定该菌株携带ctxAB基因；未出现749bp大小的扩增条带，则可判定不携带ctxAB基因。如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行试验，并排除污染因素。

酵母菌的鉴定主要根据形态特征、生长特性和形成子囊孢子和掷抱子的情况，另外还必需进行必要的生化测试。本文介绍的对食品和乳制品中分离的常见酵母菌的鉴定，主要是以形态特征为依据的。在琼脂培养基(如粗玉米粉琼脂、酵母膏琼脂〉中，25℃培养2-5d后的幼龄酵母菌菌落会出现圆丘状，边缘完整的特征性菌落，菌落为湿的奶油状，具有光泽、轻度光泽或无光泽的光滑表面，菌落颜色通常为白色、奶油色、粉红色或橙红色。经进一步培养，有些菌落变皱、发干、易碎，类似于细菌菌落，但多数细菌不能在低pH或用于霉菌、酵母菌分离计数的选择性培养基上生长。平板琼脂中酵母菌菌落表面呈现里状排列。用显微镜观察未经染色或用革兰氏碘液染色的菌体涂片，通常会发现单细胞的球形、椭圆形、卵圆形或圆柱形微生物(见图40.1)。这些微生物以二分裂或芽殖的形式进行无性繁殖。只有在用载玻片培养时才会出现假菌丝体或菌丝体。在载玻片上培养酵母菌时应使用麦芽膏琼脂或马铃薯琼脂。 （1）卵形芽殖细胞（如乳酸克鲁维酵母属，啤酒酵母菌椭圆亚种）（2）球形芽殖细胞（如德巴利酵母菌）                （3）圆形芽殖细胞（如毕亦酵母属）（4）假菌丝实例

一、用途  用于药品、生物制品无菌试验。二、原理  蛋白胨提供氮源和碳源；酵母浸粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；磷酸氢二钾为缓冲剂；无水硫酸镁为培养基提供必需的离子；琼脂是培养基的凝固剂。三、成分（g/L）此配方可以进行改良或增加营养成分以获得最佳的结果四、试验方法  1、称取本品28.3g，加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，备用  2、制备质控菌液。  3、把质控菌液加入试管中。  4、在36±1℃培养18-24小时，记录实验结果。五、实验结果  接种以下质控菌株，在36±1℃培养18-24小时：图1葡萄糖蛋白胨培养基微生物质控结果a：大肠埃希氏菌，b：伤寒沙门氏菌，c：金黄色葡萄球菌，d：单增李斯特氏菌，e：空白对照注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、用途及原理  该培养基主要用于李斯特氏菌的选择性增菌培养。  蛋白胨、酵母浸粉提供细菌生长所需的基本营养，氯化锂、吖啶黄素、多粘菌素B、头孢他啶可联合抑制多种杂菌的生长，甘露醇为可发酵碳源，酚红为酸碱指示剂，有些细菌可分解甘露醇产酸使培养基变黄，而李斯特氏菌一般不能分解甘露醇，不能使培养基变黄，但李斯特氏菌可将培养基中的七叶苷分解为七叶素，与柠檬酸铁铵中的铁离子反应变黑，因此当李斯特氏菌生长时，通常可观察到培养基变黑现象。大豆卵磷脂、吐温80为中和剂，可消除样品中一些有毒成分的抑菌作用。二、培养基配方（g/L）三、使用方法  称取本品47.38g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装三角瓶，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟，冷却后每瓶加入一套PALCAM抑菌剂（成分为已过滤除菌的吖啶黄素、多粘菌素B和头孢他啶），混匀分装至试管，备用。四、生长现象  接种以下质控菌株，在36±1℃下培养18-24小时： 左侧2支变黑试管为单增李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌生长现象，右侧红色试管为空白管 PALCAM肉汤-产品详情http://www.hopebiol.com/asphtml/product2443.htm 注：本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

一、实验用途及原理：  用途：用于药品，生物制品无菌试验。  原理：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源，氯化钠、磷酸氢二钾维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。二、培养基配方（g/L）：三、实验方法：  称取本品45.0g，溶解于1000mL 蒸馏水中分装，121℃高压灭菌15分钟，冷至45-50℃时，倾入无菌平皿。使用前，把制备好的平板放置室温10-20分钟。  1、制备质控菌液  2、将质控菌液涂布平板。  3、36℃倒置需氧培养18-24小时，记录实验结果。四、结果判定： 图1 酪胨琼脂培养基微生物质控结果注：本文属海博生物原创,未经允许不得转载。