一、试验简介
氧化酶又名细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶c或呼吸酶。通过氧化酶试验可检测细菌是否能产生该酶,主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别,前者为阴性,后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。
二、试验原理
氧化酶为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素c氧化,然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化,生成有颜色的化合物,从而表现为颜色反应。
三、试剂
1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。
四、试验方法
常用方法有以下几种:
(1)菌落法:直接滴加试剂于被检菌落上。具体操作为,取37℃培养20 h的斜面培养物一支,将2~3滴试剂从斜面上端滴下,并将斜面略加倾斜,使试剂流经斜面上的培养物。如系平板培养物,则可将试剂滴在菌落上。
(2)滤纸法:取一小块洁净滤纸,沾取少量菌,然后滴加试剂。
(3)试剂纸片法:将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片,刮取菌苔涂于试剂纸上。
其操作手法如图1所示:
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/cbdeada5-a071-471a-bd7e-fa74b6ce36e7.jpg)
图1 纸片法进行氧化酶试验的操作手法
(4)拭子法:拭子应浸入试剂中,然后与可疑的分离菌落接触,在10秒钟内注意颜色的变化。
(5)试管法:取18-24 h的营养肉汤(4.5mL)新鲜细菌培养物。加入试剂(0.2mL),摇动试管,以确保混合物充分混合,观察颜色变化。
五、试验结果
细菌与试剂接触后,在10秒内呈深紫色,为强阳性;于2min内呈现蓝色者为阳性;阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应,2min以后出现微弱或可疑反应均判为阴性结果。
为保证结果准确性,分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌作阳性和阴性对照。
六、注意事项
(1)进行测试时,试剂可能会自动氧化,因此使用新鲜试剂至关重要。为保证试剂新鲜,从配制到使用不应超过一周。
(2)纯化菌时,要选择不含过多糖类的培养基,如营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂。培养基中高浓度的葡萄糖会导致假阳性结果。
(3)如果被测微生物在含有染料的培养基上生长,则结果可能会异常。
(4)在将试剂添加到活性培养物中之前,请先将培养物进行传代培养,因为某些试剂会杀死微生物。
(5)氧化酶测试有助于鉴定奈瑟菌以及鉴定和区分革兰氏阴性杆菌。为了确定被测生物的革兰氏反应和形态,应使用革兰氏染色进行检查。
(6)刮取菌苔一定要使用铂金环、一次性塑料接种环或玻璃棒。使用包含铁的环可能会导致假阳性结果。
(7)如果所用试剂或试剂条的敏感性较低,则可能会导致假阴性结果。
(8)试纸条上滴加无菌水时,以刚刚浸湿为宜。若加水太多,会影响反应效果,延长反应时间,或无颜色反应,造成假阴性(如图2)。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/9cf0be39-436e-412e-99e6-32c7e90a79c9.jpg)
左:10 uL 右:20 uL
图2 不同用量的无菌水对氧化酶试验结果的影响
(9)确保用于氧化酶测试的菌落菌龄为18至24小时。较老的菌落,则会导致反应较弱甚至不反应(如图3)。
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202206/uepic/c4be409d-245f-4a50-b8a9-62810c6a9184.jpg)
左:24h菌苔 右:2周菌苔
图3 不同菌龄的菌苔对氧化酶试验结果的影响
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