当CRISPR 遇见Namocell---微管蛋白聚合抑制剂与癌症研究最新进展微管蛋白是一种在维持细胞结构和促进细胞分裂中起着关键作用的蛋白质。抑制微管蛋白聚合已被证明是抑制癌细胞增殖的有效策略。在以往的研究中，识别能够抑制微管蛋白聚合的化合物需要利用纯化的微管蛋白或固定细胞的免疫荧光分析进行体外实验。2023年1月29日，美国Harutyun Khachatryan研究团队在Biomolecules杂志发表了文章Identifification of Inhibitors of Tubulin Polymerization Using a CRISPR-Edited Cell Line with Endogenous Fluorescent Tagging of β-Tubulin and Histone H1，提出了一种新的方法来识别微管蛋白聚合抑制剂，利用内源性荧光标记β-微管蛋白和组蛋白H1的CRISPR - Hela细胞系来鉴定微管蛋白聚合抑制剂。该方法有助于研究活细胞内源性蛋白，而不使用细胞固定、免疫染色或重组蛋白过表达。本研究使用β-微管蛋白（mCTover3）、组蛋白H1（mTagBFP2）和p62-SQSTM1（mRuby3）荧光蛋白， 用CRISPR和FAST-HDR载体系统开发HeLa细胞，采用Hana单细胞分离仪（Namocell）进行单细胞分选，使用绿色荧光通道，并分选到96孔板中进行单细胞克隆培养，然后选择一个具有均匀明亮β-微管蛋白荧光的细胞克隆大量扩增得到实验细胞。后续实验通过高内涵成像分析来动态观察微管蛋白聚合情况。用已知的微管蛋白聚合抑制剂、秋水仙碱和长春新碱处理此细胞，并证实了由此产生的微管蛋白聚合抑制的表型变化。此外，作者筛选了429个激酶抑制剂文库，鉴定出三种抑制微管蛋白聚合的化合物（ON-01910、HMN-214和KX2-391）。值得注意的是，研究中采用Namocell 单细胞分离仪帮助作者快速、轻柔、高效地获得活性高的CRISPR - Hela单细胞，利于单克隆培养及扩增，为后续更多实验提供足够的细胞工具。Namocell单细胞分离仪 l  轻 柔 - 压力小于2psi，保护细胞活性l  快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）l  精 准 - 配备2-11色荧光通道，精准捕获目的细胞l  无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染l  轻 松 - 无需调校，开机即用l  轻 巧 - 体积小巧，方便搬动Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于世界领先的单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。

无创产前筛查：Namocell分离单个妊娠早期循环胎儿细胞帮助建立无创产前诊断基础 讲座主题内容：1.     历史性挑战--建立基于胎儿细胞的无创产前诊断cbNIPT2.     Luna产前诊断如何实现分离和分析单个妊娠早期循环胎儿细胞3.     Luna产前诊断是如何在病人护理和生殖健康方面产生积极影响的 目前常规的产前诊断技术如羊膜穿刺活检、绒毛膜活检CVS、脐带穿刺术和脐血取样法均具有应激性和侵入性，可能引起早产、感染、母体免疫反应等风险。而在妊娠早期，母体血液循环中发现一些来自胎儿的细胞，即妊娠早期循环胎儿细胞。从母体血样中分离这些胎儿细胞是代替传统侵入式产前诊断的一种非常有利的方法，不仅可以实现低风险的非侵入性产前检测 (NIPT)，同时能够分离纯的完整胎儿基因组。然而，该方法的主要难题在于胎儿细胞含量极少，大约为2～6个/mL孕妇外周血，所以需要从母体血液中富集分离出纯度好的完整的胎儿细胞，并对全基因组扩增的胎儿 DNA 进行遗传分析，这有一定的技术难度。要实现这一点，需要高效的上游富集，使用足够的细胞类型特异性标记进行检测，并通过轻柔快捷灵活的方式分离单细胞，从而最大限度地减少稀有细胞的损伤和丢失。目前较常用的分离纯化胎儿细胞的方法包括：流式细胞分选（FACS），磁珠分选（MACS），密度梯度离心法，电流分离法(CFS)，显微操作分离单个细胞法，微流控芯片等。但这些传统的方法分离到的胎儿细胞往往活性差，或应激基因表达上调，或目的细胞回收率低，或操作繁琐，费时效率低等。如今，美国Luna Genetics公司采用Namocell 单细胞分离仪可以轻柔快速高效地获得单个妊娠早期循环胎儿细胞，建立了无创产前诊断方法的基础。想要了解Namocell具体如何实现分析和分离单个妊娠早期循环胎儿细胞，可以关注下面的网络讲座!3月17日Namocell邀请Luna Genetics科学家Mason Ouren带来精彩讲座《Luna无创产前诊断新方法--通过分离妊娠早期循环胎儿细胞进行无创产前诊断》。 讲座时间：2023.3.17  美国东部时间下午2点(北美中部夏令时间下午1点/太平洋东部时间上午11点)                   中国时间凌晨3点（直播结束后会有回放录像，联系Namocell可以获取）                   报名点击Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。免责声明：Namocell产品仅供研究使用，不用于诊断目的。

     2022年10月19日，美国国立卫生研究院干细胞中心的Carlos Tristan团队在《nature protocols》上发表题为“Efficient and safe single-cell cloning of human pluripotent stem cells using the CEPT cocktail”的论文（doi: 10.1038/s41596-022-00753-z），公布其确立的人多能干细胞单细胞克隆技术实验方法。文章中详尽介绍了人多能干细胞研究的各个步骤的操作方法和关键点。包括复苏，复苏后培养，染色，单克隆分选+分离，单克隆培养，细胞干性验证，克隆扩增，细胞冻存，细胞系分析等方面的内容。文中阐述了标准化的工作流程，这种先进的实验流程促进了干细胞自我更新的生存能力和适应性。为可扩展出的基因编辑，细胞系开发，疾病建模和再生医学等方面的应用奠定了夯实的基础。人多能干细胞（hPSC）具有广泛的自我更新能力，可以分化为人体内所有的细胞类型，在基础科学和临床医学方面都具备极大的研究价值。但是hPSC又是固有的敏感细胞，在体外极易受到外部环境扰动的影响。hPSC的单克隆分离和单克隆细胞系的建立长期以来都是研究中的巨大挑战，其中细胞克隆效率低下是多能干细胞研究简化和标准化的主要障碍。NIH经过长期的筛选，确立了一种化学定义的小分子化合物组合CEPT（chroman 1，emricasan，polyamines，trans-ISRIB）进行稳健的细胞克隆，以安全和高效的方式从hPSC中生产出遗传稳定的单克隆细胞系，并进行连续的传代。这不仅有助于开发药物和个性化细胞治疗的先进策略，还有助于在干细胞生物学领域进行更深一步的可重复的可靠的研究。文中对比了基于流式细胞术的单细胞分选方法、基于图像的单细胞打印方法和基于微流控的单细胞分选方法，选择了对细胞极其温和，不仅能够快速分离单个细胞，而且能够保持细胞活性，并且仪器设置用时短和单块96孔板分选快的Namocell微流控单细胞分选仪。确立了用户友好的微流控细胞分选来完成整个干细胞单克隆分选方案，配合小分子化合物组合CEPT，干细胞单克隆保持了原有的形态学特点，减少细胞膜空泡化，维持其圆润程度。后续的核型和WES分析再一次确认了细胞完全正常。Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于世界领先的单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。联系我们：400-086-5580

022年11月28日， Zhan et al.研究团队在The Plant Journal杂志发表文章Coexpression network and trans-activation analyses of maize reproductive phasiRNA loci，鉴定了与玉米花药发育相关的时序基因共表达网络（模块），包括两个高度富集的21-或24-PHAS位点的模块。作者利用Bulk-protoplast RNA测序对玉米原生质体进行逆转录分析，发现2个与21-PHAS位点共表达的转录因子可以激活几个21个核苷酸phasiRNAs通路基因，但不能激活21-PHAS位点的转录。同时使用单细胞（原生质体）RNA测序的24-PHAS位点的转录调控因子，也都没有检测到21-PHAS或24-PHAS位点的可重复激活。研究结果表明，玉米花药中的内源性转录机制和/或染色质状态是激活生殖PHAS位点所必需的。【重点】通过单细胞（原生质体）RNA-Seq筛选共同调控生殖PHAS位点的TF组合为了确定减数分裂前转录因子的任何组合是否可以共同激活21-PHAS位点或与21-核苷酸phasiRNA通路相关的基因，作者在玉米叶片原生质体中瞬时表达了上述原生质体RNA-Seq分析中使用的所有结构，包括23个转录因子结构和p35S：：GFP质粒。使用Namocell Hana单细胞分离仪分离GFP阳性原生质体，其中96个单原生质体，以下称为PS1（原生质体组合1），用于单细胞（原生质体）RNA-Seq处理。为了确定MS23、MS32、bHLH51和bHLH122的任何组合是否可以共同激活24个-PHAS位点或24个核苷酸的phasiRNA通路基因，作者还对另一组96个原生质体（原生质体组合2；PS2）进行了单一原生质体RNA-Seq实验，转染了8个表达4个bHLHs的质粒，每个都作为与GFP的N端和c端融合，以及p35S：：GFP（表S11）。所有192个原生质体的PCA显示，这两个细胞群在第二主成分上可以很好地分离出来（图4a），表明两个TF构建库在原生质体中激活了不同的基因表达程序。在每一组原生质体中，表达大量结构的原生质体通常与那些没有可检测到的构建特异性转录本的原生质体不同（图4a），这进一步支持了单个原生质体的不同转录组谱是由于转录因子的异位表达所致的观点。Namocell单细胞分离仪轻 柔 - 压力小于 2psi，保护细胞活性快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）精 准 - 配备 2-11 色荧光通道，精准捕获目的细胞无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染轻 松 - 无需调校，开机即用轻 巧 - 体积小巧，方便搬动扫描下面二维码参与调研详细了解Namocell 单细胞分离仪与技术面对面交流更有机会获得精美礼品~     Namocell 是一家成立于美国硅谷的专注于世界领先的单细胞分选技术的生物仪器公司，2022年7月加入Bio-Techne。公司自主研发的微流控单细胞分选平台，使复杂的单细胞分选变得极其简单快速，极大地推动了单细胞分析在基础研究和临床上的应用。我们的单细胞分选仪已在细胞株的构建，单克隆抗体的筛选，细胞基因编辑，基因及细胞治疗，癌症液体活检，癌症免疫治疗，产前基因筛查，噬菌体展示，单细胞基因组学等多方面得到广泛的应用。目前Namocell微流控单细胞分选仪已经被世界各大顶尖研究机构及生物制药公司广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如美国国立卫生研究院(NIH)，美国食品药品监督管理局 (FDA)，美国疾病控制与预防中心(CDC)，哈佛大学，斯坦福大学，麻省理工大学，Genentech，Merck，Biogen，BMS，Janssen，Boehringer-Ingelheim等。原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.16045

Bio-Techne 旗下子品牌 Namocell 的单细胞分离仪 (Namocell Single Cell Dispensers) 采用先进的微流体技术以及灵敏的光学检测系统，在精确鉴别细胞的同时又能对目的细胞进行单细胞分离分选至 96 孔板或 384 孔板中。Namocell 单细胞分离仪完美结合了三项重要技术，实现单细胞快速、轻柔、准确地分离。采用流式细胞术进行细胞检测，利用激光激发，荧光和散射光的接收来判断细胞特性，检测精度高。采用微流控芯片检测分离细胞，在极低的鞘液压力下（一：产品特性轻柔---保护细胞活性Namocell 单细胞分离仪发挥微流体技术的低鞘液压力优势，在整个分离过程中系统给流体的加压＜2 psi，对细胞极其轻柔，保护细胞活性，促进细胞后续生长。以下是 Namocell 与两款传统的FACS流式细胞仪进行细胞铺板生长情况对比，结果显示，用 Namocell 单细胞分离仪进行单细胞铺板的结果普遍优于用FACS铺板的结果。灵活---适用各种样本浓度Namocell 采用微流控芯片进行细胞分选，死体积小，样本浪费少。因此对于少量珍贵细胞样本。当细胞数量少于一百个时，也可轻松完成单细胞分离。独有的富集分选模式，可以在细胞密度很高的状态下（1.5x10^8 cells/mL）挑选含量极低的（快速---96孔板只需1分钟Namocell 单细胞分离仪是目前市场上最快速的单细胞分离系统：1. 分选速度快：96孔板仅需1分钟即可完成分选，6分钟内可完成384孔板分选。2.整体流程速度快：开机无需任何调试且无需微球进行复杂的drop delay校准。2分钟内一键自动完成初始化，开始细胞分选。1分钟内完成样本切换，2分钟内完成设备关机。 轻巧---整机小巧，方便移动整机体积小巧，轻便。尺寸是50 × 36 × 20cm，重量9kg，相当于小型家用微波炉的体积与重量，不占实验室空间方便移动。尤其对于无菌要求高的实验，可以将Namocell 单细胞分离仪放进超净台中使用。无菌---一次性芯片，杜绝交叉污染细胞分选的实验绝大多数需要无菌环境，Namocell 单细胞分离仪在设计上为无菌要求做到了三重保护：1. 体积小巧：方便整机置于超净台中进行细胞分选操作；2.一次性芯片，零污染：从根本上杜绝了样本之间相互污染的可能性，用户可在同一台仪器上分离细胞、细菌、酵母等生物样本，无需为样本交叉污染而担忧；3.专属管路，无残留，无堵塞：Namocell 采用的专属管路设计，确保样本在检测前不会流经共用通道。完全杜绝了 FACS 常见的系统堵塞以及样本残留在管路中的现象。轻松---使用简单，无需专人维护Namocell 单细胞分离仪只有一个硬件开关，是真正的“一键启动”，并且启动后无需预热，无需调校，开机后可立即使用。使用极其简便，每一步都有软件自动提示，无需流式经验，能够让每个人都成为细胞分选高手。二：应用领域Namocell 单细胞分离仪已经广泛应用于生命科学的各个领域。在生物制药领域，用于细胞株构建、抗体药物开发；在肿瘤医学方面，用于稀有循环肿瘤细胞的分离；在植物学领域，用于原生质体的分离；在CRISPR基因编辑领域，用于工程细胞株的开发以及iPSCs的单克隆细胞培养；在单细胞分析方面，用于单细胞测序和单细胞质谱的前处理过程等等。扫描下方二维码参与调研详细了解Namocell单细胞分离仪与技术面对面交流，更有机会获得精美礼品~

2023年5月，《Nature Biotechnology》（IF=46.9）上发表的文章Hypoimmune induced pluripotent stem cells survive long term in fully immunocompetent, allogeneic rhesus macaques，揭示了低免疫的诱导多能干细胞（HIP）能在具备完全免疫能力的同种异体恒河猴体内长期存活，大大改善了受体的糖尿病，这为细胞治疗应用带来突破性的进展。HIP同种异体细胞治疗可以有效防止受体免疫系统的排斥反应，这将大大减少对免疫抑制药物的需求，并且HIP编辑有助于细胞产品的大规模生产形成通用细胞疗法。文章作者通过敲除HLA I类和HLA II类分子并过表达CD47 (B2M−/−CIITA−/−CD47+)来生成小鼠和人的低免疫诱导多能干细胞（HIP）。为了确定这种方案在非人类灵长类动物中是否成功，作者编辑了恒河猴HIP细胞，并将其通过肌肉注射移植到四只异体恒河猴体内。HIP细胞在具有完全免疫能力的同种异体受体中存活了16周，并分化为几个谱系，而同种异体野生型细胞则被强烈排斥。作者还将人HIP细胞分化为具有内分泌活性的胰岛细胞，并验证它们在免疫能力强的异体人源化糖尿病小鼠体内存活了4周，并有效改善了糖尿病情况。另外，HIP编辑的原代恒河猴胰岛细胞在异体恒河猴受体中存活了40周，没有发生免疫抑制，而未编辑的胰岛细胞很快被排斥（见图6）。图6. HIP编辑的原代恒河猴胰岛细胞在异体恒河猴受体中存活40周在基因编辑恒河猴HIP细胞过程中，作者采用Namocell单细胞分离仪来分选出编辑成功的HIP单个细胞，并成功培养成HIP单克隆，用于后续实验研究。文章作者比较了不同的基因编辑方案，最终表明B2M−/−CIITA−/−CD47+HIP免疫编辑能有效地防止异体的适应性免疫应答和先天性免疫激活。同时进一步表明，HIP编辑可以应用于iPSCs和一些特定的原代细胞，并且证实了它们在非人灵长类动物中的免疫逃避特性。恒河猴HIP iPSCs和HIP胰岛细胞可以在同种异体免疫受体中长期存活。HIP编辑技术可以用于大规模生产细胞产品，促进通用细胞疗法的发展。扫描下面二维码参与调研详细了解Namocell 单细胞分离仪与技术面对面交流更有机会获得精美礼品~Namocell单细胞分离仪★ 轻 柔 - 压力小于 2psi，保护细胞活性★ 快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）★ 精 准 - 2-11 色荧光通道，精准捕获目的细胞★ 无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染★ 轻 松 - 无需调校，开机即用★ 轻 巧 - 体积小巧，方便搬动

近期，一篇文章报道了巨噬样细胞的SAMHD1基因编辑最新进展，揭示了SAMHD1磷酸化调控、HIV-1限制和细胞dNTP水平之间的复杂关系。SAM和HD结构域蛋白1 (SAMHD1)是一种dNTP三磷酸水解酶(dNTPase)和免疫缺陷病毒1 (HIV-1)的有效限制性因子，活跃在骨髓细胞和静息CD4+ T细胞中。SAMHD1的抗病毒活性受残基T592的去磷酸化调控。然而，T592磷酸化对dNTPase活性的影响仍存在争议。SAMHD1的其他细胞功能是否影响抗病毒限制尚不完全清楚。作者报道了BLaER1细胞作为一种新的人类巨噬样细胞HIV-1感染模型结合CRISPR/Cas9敲入(KI)技术将特异性突变引入 SAMHD1位点以研究生理背景下的突变。转分化的BLaER1细胞含有活性去磷酸化的SAMHD1，可阻断HIV-1报告病毒的感染。正如预期的那样，纯合子T592E突变，而不是T592A，缓解了HIV-1逆转录的阻滞。将VLP-Vpx共同递送到SAMHD1 T592E KI 突变细胞中并没有进一步增强HIV-1感染，这表明缺乏独立于T592去磷酸化的SAMHD1介导的额外抗病毒活性。T592E KI细胞保留的dNTP水平与WT细胞相似，表明SAMHD1的抗病毒和dNTP酶活性解耦。SAMHD1中催化位点的完整性对于抗病毒活性至关重要，然而在携带催化核心突变的细胞中观察到HIV-1 限制与整体细胞dNTP水平的低相关性。总之，强调HIV-1限制，SAMHD1酶功能和T592磷酸化调节之间关系的复杂性，为内源性和生理背景下的研究提供了新的工具。 研究中作者将BLaER1细胞进行CRISPR/Cas9基因编辑后，使用Namocell  Hana单细胞分离仪进行单细胞分选，或者有限稀释法进行单克隆培养，筛选出目的细胞克隆。图3. CRISPR/Cas9敲入产生SAMHD1突变体的流程扫描下面二维码参与调研详细了解Namocell 单细胞分离仪与技术面对面交流更有机会获得精美礼品~Namocell单细胞分离仪★ 轻 柔 - 压力小于 2psi，保护细胞活性★ 快 速 - 分选快（1min），初始化快（2min），样本切换快（1min）★ 精 准 - 2-11 色荧光通道，精准捕获目的细胞★ 无 菌 - 一次性无菌芯片，隔绝样本污染★ 轻 松 - 无需调校，开机即用★ 轻 巧 - 体积小巧，方便搬动

克隆表达重组抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是开发单克隆抗体(mAb)治疗方法的至关重要的载体。寻找高IgG克隆的过程通常涉及大量的克隆筛选，费力又耗时。冷捕获技术使得这种筛选效率更高。该技术在低温条件下，用荧光分子标记产生抗体的细胞与分泌的靶点蛋白结合。这种标记帮助实现基于荧光信号水平的细胞分选，以选择更高生产率的细胞。Biogen，Pfizer等公司一致表明冷捕获和单细胞分离相结合是一种高效获得高富集IgG单克隆的方法。使用Namocell Pala单细胞分离仪进行单细胞分离，结果显示与非冷捕获细胞相比，冷捕获标记细胞的IgG产量平均高3倍左右。目前常见的单克隆分离方法：有限稀释将细胞稀释到极低密度使得每个孔仅含有一个或更少的细胞，此方法高度依赖人工，获得率低且耗时。FACS需要大量的起始细胞且分选过程会对细胞产生较大的压力，影响细胞活性。Namocell Pala 单细胞分离仪与传统的FACS相比，该技术具有：•低鞘液压力(•操作简单，无需专门维护。固定光路，无需校准，开机即用•整机轻巧，可置于生物安全柜中•一次性分离芯片，样本无共用管道，杜绝了样本间的交叉污染细胞株开发时，单克隆的筛选和分离是取得成功的关键步骤。Namocell Pala 单细胞分离仪结合冷捕获技术获得高表达IgG克隆。该方式可以简化加速工作流程，为下游生产出更多优质高产的细胞。更多精彩内容，扫描下方二维码免费获得Webinar视频更有机会获得精美礼品~

在药物发现和开发的动态过程中，从开创性研究到工业规模生产，效率以及数据的可靠性是每个阶段的驱动力。尽管技术进步为当今药物发现和开发的各个方面增添了光彩，但挑战仍然存在，需要更新工具和技术来加快这一进程。那么在细胞系开发中，特别是单克隆分离方面，我们该如何应对这些挑战？1.什么是单克隆分离? 单克隆是指基因完全相同的细胞群，也意味着它们需要来源于同一个细胞。经过工程改造的细胞群需要进行单独分析并分选，这一过程也被称为单克隆分离，是确保遗传同致性的基本步骤。单克隆分离也验证了引入的基因改变和观察到的表型之间的关系，并为后续步骤提供了可靠的基础。2.单克隆分离的现有技术和挑战  流式细胞分选(FACS)和有限稀释法是两种常用的单克隆分离技术。FACS是根据细胞的荧光特性分选细胞。一旦细胞被荧光标记物标记，将其引入到FACS仪器中，并根据特定的标准测量其荧光强度，从而决定是否分选细胞。值得注意的是，FACS的分选过程是在高压(30-70 psi)和高速流动下进行的，可能会导致细胞损伤和应激反应，从而影响分选后细胞的存活率1。另外，流动池和管路的尺寸较小，堵塞也是传统FACS长期存在的一个问题。管路疏通会占用仪器大量的操作时间，推迟整体的实验计划。而且在非无菌环境中共用流体管路来操作，会大大增加污染的风险。有限稀释法是一种更加温和的技术，通过连续稀释细胞悬液来降低细胞密度。虽然细胞不再受高压力或依赖其荧光特性，但有限稀释法是一个手动的劳动密集过程，极易出错。而且有限稀释法的单细胞沉降概率要遵循泊松分布，导致整体单细胞效率低且不可靠2。3.全自动柔性单细胞分离仪Pala的优势Pala单细胞分离仪是专门应对上述挑战而设计的。结合微流控技术、流式细胞术和液滴分配技术，在＜2psi的低压下对细胞进行分选，可分别在1分钟和6分钟内将细胞分选到96或384孔板中。在节省大量分选时间的同时获得健康且有活力的细胞。Pala单细胞分离仪保证了较高的单细胞效率，单细胞入孔率超过90%。自动化设计使得操作简单直观，不需要专门的操作人员和大量的应用培训。小巧轻便的设计允许其可以完全在超净台内完成操作，一次性细胞芯片避免了样本间的交叉污染。扫描下方二维码参与调研详细了解全自动柔性单细胞分离仪Pala与技术面对面交流更有机会获得精美礼品~

干细胞技术的进步为其他医疗手段无法治疗的疾病带来新的曙光。以干细胞为基础的治疗，包括人类多能干细胞（hPSCs）和多能间充质干细胞（MSCs）彻底改变了干细胞研究和基于细胞的治疗，开辟了再生医学的新时代。由于人类多能干细胞（hPSCs）是固有的敏感细胞类型，单细胞解离和建立克隆细胞系是长久以来存在的挑战。最近由美国国立卫生研究院干细胞转化实验室（SCTL）的研究团队发表的一项新的单细胞克隆方案有望改变hPSC克隆的难题。该方案基于微流控技术，在极低的压力下，快速而轻柔的将单个细胞分配至96或384孔板中。同时CEPT小分子混合物在解离后最大程度的维持了细胞的结构和功能，从而建立安全高效的从 hPSCs中产生基因稳定的克隆细胞系。单细胞分离仪Pala结合了创新的微流体技术、流式细胞术和液体分配技术，可在1分钟内将单个细胞筛选分离到96孔板中，384孔板也仅需6分钟。极低的流体压力（＜2psi）确保分选后细胞的活性和功能。一次性分离芯片，最大限度的避免了样本间的交叉污染，让单细胞分离变得轻而易举！主讲嘉宾Singeç博士曾担任美国国立卫生研究院（NIH）旗下国家转化科学进展中心（NCATS）的干细胞转化实验室（SCTL）主任。他专注于制定创新性战略，促使iPSC研究向临床前和临床应用领域的转化，包括药物发现、基因编辑、细胞治疗等。内容摘要1. 在下游应用中，如何快速简便地分离单个细胞2. 讨论如何提高遗传稳定的人类多能干细胞（hPSCs）的存活率3. CEPT小分子混合物如何实现干细胞稳健的生长更多精彩内容，扫描下方二维码免费获取Webinar视频

CRISPR/Cas9作为最具开创性的工具之一，可以精确和高效地修改基因组序列来研究基因功能、疾病机制和治疗方法。当与iPSCs相结合时，CRISPR/Cas9通过促进iPSC基因组的精确编辑来创建疾病特异性遗传畸变模型，从而展现出非凡的力量，这对于研究疾病机制和开创新型治疗方法具有重要价值。此外，纠正iPSCs中的遗传异常使科学家能够生成针对特定免疫特征的定制细胞，为针对广泛疾病的个性化细胞治疗打开了可能性。然而，尽管CRISPR技术在细胞工程中带来了巨大性的潜力，但仍存在与脱靶编辑和可变编辑效率相关的挑战。因此，为了识别具有所需特征的克隆细胞，分离克隆群体对编辑细胞的进一步表征至关重要。单克隆筛选，确保每个被研究的线都具有异质的基因组构成，同时保持一致的生物行为。单细胞分离仪Hana和Pala助力基因编辑后筛选最佳克隆，越来越被顶尖科学家和研究人员所认可。Hana和Pala结合创新的微流体技术、流式细胞术和液体分配技术，可在几分钟内将单个细胞筛选并分离到96或384孔板中。低系统压力(扫描下方二维码询价、申领资料01.免疫系统对细胞疗法的排斥反应是细胞工程及细胞疗法开发过程中至关重要的一步。本研究揭示了低免疫的诱导多能干细胞（HIP）能在具备完全免疫能力的同种异体恒河猴体内长期存活，大大改善了受体的糖尿病。在基因编辑恒河猴HIP细胞过程中，通过CRISPR基因失活创建B2M-/-CIITA-/- iPSCs，有效地防止异体的适应性免疫应答和先天性免疫激活。作者采用单细胞分离仪Hana来分选出编辑成功的HIP单个细胞，并成功培养成HIP单克隆。02.这项研究重新审视了腺苷酸单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）在自噬中的作用，揭示了AMPK的双重功能：在能量不足时调节自噬的即时诱导，同时保留重要的自噬组分。这种双重角色对于在能量压力下维持细胞平衡和生存至关重要。单细胞分离仪Hana在CRISPR编辑后创建各种敲除（KO）和双敲除（DKO）细胞系中发挥了关键作用。使用单细胞分离仪Hana分选GFP阳性细胞并进行单细胞克隆，建立了明确的克隆系。KO细胞系对于阐明被编辑的基因的功能起到了重要作用。03.非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）影响全球20-25%的人口，这一数字随着肥胖的普遍增加而加剧，而治疗方案却很有限。利用CRISPR/Cas9工程，研究团队在HEK293T细胞系中使用荧光素酶报告基因标记了内源性血红素氧合酶-1（HMOX1）基因。然后单细胞分离仪Hana对经过编辑的细胞进行分选，建立单克隆体系。单克隆作为后续药物化合物筛选的基础模型。单细胞分离仪Hana在研究方法中发挥了关键作用。04.本文揭示了识别微管蛋白聚合抑制剂的一种新方法，利用内源性荧光标记β-微管蛋白和组蛋白H1的CRISPR - Hela细胞系来鉴定微管蛋白聚合抑制剂。使用β-微管蛋白（mCTover3）、组蛋白H1（mTagBFP2）和p62-SQSTM1（mRuby3）荧光蛋白， 用CRISPR和FAST-HDR载体系统开发HeLa细胞。研究中采用单细胞分离仪Hana帮助作者快速、轻柔、高效地获得活性高的CRISPR - Hela单细胞，利于单克隆培养及扩增，为后续更多实验提供足够的细胞工具。05.该研究旨在通过削弱化疗耐药性来改善癌症治疗结果。采用CRISPR编辑引入能够使特定基因失效的突变。在实际应用中，研究团队使用了肺癌细胞系，编辑了NRF2基因并引入了两个突变。通过两轮编辑和克隆以开发所需的细胞系，单细胞分离仪Hana高效地分配了单个细胞，简化了生成携带突变的肺癌细胞系的繁琐过程。06.骨质疏松症是一种普遍存在的与年龄相关的以骨密度降低为特征的骨骼疾病。尽管潜在的治疗方法BMP-2和CK2.3通过BMP信号通路起作用，受限于副作用及严格的使用限制。借鉴一个细胞系模型，该模型通过CRISPR-Cas9使BMPR1a受体（与BMP-2相关）敲除BMPRIa 基因，这项研究成功揭示了C57BL/6（B6）小鼠品系作为骨质疏松症研究的可靠模型。单细胞分离仪Hana将编辑后的细胞群进行分选，成为敲除细胞系的关键步骤，利于单克隆的后续培养和扩增。07.本文章主要研究HIV-1在人类巨噬细胞中的感染。引入 BLaER1 细胞作为替代髓系细胞模型，结合 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑，对SAMHD1催化核心位点引入突变，研究SAMHD1的抗病毒功能。这种新颖的方法为制定精确靶向SAMHD1的策略铺平了道路，而无需对其他细胞操作产生意外干扰。这项研究创新的核心，即成功创建的敲除和敲入细胞系。Namocell单细胞分离仪进一步强调了它在推动细胞研究方法学方面的重要性。

目前，包括单抗、双抗、多抗治疗性蛋白药物已成为生物制药市场的主导产品类别之一。在制备这些治疗性蛋白药物时，单细胞克隆技术的应用对于确保产品质量的一致性和避免人为干预至关重要。通过有限稀释进行单细胞筛选耗时且低效，传统FACS技术昂贵的设备及人员培训又筑起了一道高门槛。阿斯利康对比了传统FACS与Namocell单细胞分离仪Pala, 结果表明与FACS衍生细胞系相比，Pala具有相当甚至更优的细胞生长和生产能力，且操作简单，运行/维护成本低，可以作为替代FACS更具性价比，高效便捷的选择。01试验方法1将转染后的细胞进行荧光标记，通过FACS和单细胞分离仪Pala将单细胞分离至384孔板中2 对分配后的细胞进行成像和克隆生长评估，以确定单细胞克隆的成功率。3 通过小规模补料分批培养评估不同克隆来源的细胞系的生长特性和生产能力。02研究结果1Pala 的单细胞分离效率高达96.3%，细胞活率高，生长2周后无空孔2在易于表达的单克隆抗体和不易于表达的非单克隆抗体模型中，对于生长状况和产量滴度来说，FACS和Pala无明显差异。3在两种模型中，无论是滴度、Qp、分裂速率、最大细胞密度、活率均无明显差异。4Pala与FACS相比，机器小巧轻便可放置在安全柜中，易于无菌操作。开机校准时间短、关机流程简单迅速、鞘液消耗更少、耗材成本低、易于终端用户操作、仪器维护成本更低。单细胞分离仪Pala结合微流控技术、流式细胞术和液滴分配技术，在＜2psi的低压下对细胞进行分选，可分别在1分钟和6分钟内将细胞分选到96或384孔板中。在节省大量分选时间的同时获得健康且有活力的细胞。Pala保证了较高的单细胞效率，单细胞入孔率超过90%。自动化设计使得操作简单直观，不需要专门的操作人员和大量的应用培训。小巧轻便的设计允许其可以完全在超净台内完成操作，一次性细胞芯片避免了样本间的交叉污染。如果您对单细胞分离仪感兴趣扫描以下二维码进行产品资料申请/讲座预约/技术交流/询价

为了给予中国客户更优质的体验，ProteinSimple官网已顺利和Bio-Techne集团整合迁移。原网站将于8月16日起停止访问。您可以登录 www.bio-techne.com 进行访问。Bio-Techne (NASDAQ:TECH)，致力于为生命科学和临床诊断研究人员提供高品质的试剂、仪器、定制生产和检测服务。旗下拥有 R&D Systems®、Novus Biologicals®、Tocris®、ProteinSimple®、PrimeGene® 和 ACD 等众多一线品牌，形成了独特的产品和服务组合。科学赋予我们激情，促使我们合作、开发和制造出屡获殊荣的研究工具，让您获得可重复和一致的实验结果。无论您是处于学术研究的顶端，亦或是引领转化医学的潮流，还是追求诊断检测的巅峰，我们的创新产品及服务为您提供完整的解决方案。Bio-Techne品牌名称的奥义[Bio]希腊语，意为生命。这是公司产品与服务的基石，指引我们持续创新。[Techne]希腊语，意为将知识运用于实际。这是公司追求的宗旨，让我们创造非凡。

►►►全自动多功能超灵敏荧光Western带来Western Blot技术革新ProteinSimple在全球正式发行Stellar超灵敏荧光检测试剂盒，搭载在全自动多功能超灵敏荧光Western蛋白质分析平台Jess上（Digital Western Blot），提供了自动化高灵敏荧光免疫蛋白检测技术解决方案。该技术方案特别适合细胞信号通路和药理药效研究，对分子量相近的磷酸化蛋白/总蛋白同时检测，实现了一次运行多重蛋白表达分析能力，高灵敏度也实现了复杂样本中低丰度蛋白质的准确定量。传统化学发光及荧光Western Blot方法检测磷酸化蛋白是一项费时费力的工作。为了解决传统技术挑战，克服传统蛋白质印迹众所周知的局限性，ProteinSimple已经开发了全自动多功能蛋白质表达定量分析技术平台，再搭配超灵敏荧光检测技术，可更加简单、高效地完成细胞信号通路研究中磷酸化蛋白检测。►►►Stellar开启自动化荧光Western新纪元Figure 1  Stellar荧光检测灵敏度是通过DNA与检测抗体相连的多个信号放大步骤实现。全自动多功能超灵敏荧光检测试剂盒Stellar使用专利的非酶促寡核苷酸扩增技术不断地将免疫反应信号放大，并且通过 Jess 的 NIR/IR 荧光检测，在低于 1 pg 的检测水平下提供超高的荧光灵敏度，以及出色的重现性和 4-log 动态范围。凭借这一灵敏度的飞跃，Stellar荧光检测可与广泛认可的化学发光检测灵敏度相媲美，并取代了需要50pg检测水平的传统蛋白质印迹成像技术的荧光检测。►►►全自动多功能超灵敏荧光Western技术优势◆化学发光、红外 (IR) 和近红外 (NIR) 荧光通道中使用标准蛋白质印迹抗体的多通道免疫检测，可实现基于通道和基于大小的多重蛋白质表征；◆全自动、超灵敏荧光Western：可从微量样品中（低至 3 μL样本需求）中获得最多的数据，短至 3 小时快速获得结果，定量更精准，重复性更高，省时省力；◆配备同一毛细管中执行两次连续免疫测定RePlex™技术，检测更多目的蛋白质或通过总蛋白质含量归一化分析，比使用内参蛋白更可靠；◆解决传统Western blot图片误用或造假问题，Digital Western blot系统软件符合FDA CFR Part 11合规标准，全程追踪记录，原始记录不可篡改。◆科学家广泛认可，全自动Simple Western即Digital Western Blot技术平台已用于近2000篇高影响力文章中，是一项经过验证的技术，权威可靠。Figure 2 Stellar NIR 和 IR 荧光多重检测的AKT总/磷酸化蛋白。来自 Jurkat 细胞（用 calyculin A 处理）的裂解物 (0.2 mg/mL)，并使用小鼠抗总 AKT 和兔抗磷酸 AKT 一抗以及 Stellar Mouse IR（绿色条带）和 Stellar Rabbit NIR（红色条带）检测模块进行探测。Stellar NIR / IR 通道能够在同一泳道中多重检测总 AKT 和磷酸化 AKT，并具有出色的重现性（ 24 个泳道: pAKT 扫码获取更多资料►►►关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

眼部疾病基因治疗仍面临很多挑战，评估疗法的安全性风险，验证有效性，更好地支持临床试验研究开展，需要开展系统性地非临床研究。在药理学、药代动力学和毒理学等非临床研究中，选择合适的动物模型来检测目的基因表达和相关的生物学活性非常重要。本文介绍了转基因目的蛋白表达检测技术，详细说明了新技术Digital WB在不同临床前动物模型上应用进展。      近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。眼睛作为免疫豁免器官，视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞是几种遗传性视网膜疾病基因疗法的重要靶细胞。遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。作为基因治疗的理想候选者，2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。如治疗色盲的CNGA/CNGB，治疗无脉络膜症的CHM/REP1，治疗Leber 先天性黑蒙的RPE65，治疗X连锁视网膜色素变性（x-linked retinitis pigmentosa）的RPGR。      尽管眼睛对其他器官有相对优势，但眼部疾病基因治疗仍然具有挑战性如基因疗法生产、临床试验设计和长期安全性方面。需系统地开展非临床研究来评估安全性风险，验证有效性机制，以支持临床试验研究。在体内和体外模型中研究产品与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。小鼠动物模型案例1：Digital WB检测小鼠眼角膜内转基因蛋白和相关蛋白表达水平      先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED)是一种罕见的原发于角膜内皮的常染色体隐性遗传病，临床特征为出生时或生命早期出现双侧弥漫性角膜水肿和混浊。由于膜转运蛋白 SLC4A11功能丧失而导致内皮细胞凋亡。本研究采用124只小鼠，53只Slc4a11+/+作为对照，71只眼前房注射AAV9- Slc4a11和空AAV载体。      为了测定病毒转导效率，即AAV9-HA-Slc4a11 转导至 Slc4a11-/- (KO) 动物的角膜内皮细胞效率，AAV9-Slc4a11具有血凝素（Hemagglutinin，HA）标签，通过Digital WB检测HA标签表达水平来反应转导水平。结果显示年轻和年老动物组都实现了AAV载体转导的蛋白质表达，而且水平相当。      Slc4a11-/- (KO)小鼠眼角膜乳酸流出减少，导致乳酸在基质中累积，随着年龄增长而进展。乳酸转运蛋白MCT1、2和4在角膜内皮细胞中具有活性。采用Digital WB（WES Immunoassay）检测小鼠眼角膜内皮层细胞蛋白质表达，在年轻动物中，观察到MCT1和2蛋白质表达水平轻微上调，而MCT4表达显著增加。在年长动物中，乳酸转运蛋白表达升高，但水平改变不显著。      综合多角度研究，揭示了在年轻动物组，AAV9- Slc4a11将CHED表型如角膜水肿、内皮细胞丢失、线粒体氧化应激、乳酸转运蛋白表达和角膜乳酸浓度逆转恢复到正常野生型动物水平。年长动物没有逆转表型，但是仍能阻止疾病进展。这些都表明了采用基因治疗可能对CHED表型进行功能性挽救，更重要的进行早期干预治疗。      本研究充分证明了，在AAV基因治疗小鼠眼角膜样本中，Digital WB可利用微量眼角膜样本准确定量角膜内皮细胞中蛋白质表达水平变化。案例2：Digital WB用于AMD小鼠模型RPE和视网膜中小分子量蛋白质表达分析      自噬（Autophagy）在年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病进展中起着重要作用。靶向自噬在具有早期AMD特征的小鼠模型中可减缓功能障碍。研究表明，针对增强自噬途径具有治疗早期 AMD 潜力。采用野生型小鼠（WT）和缺乏APEO（载脂蛋白E）小鼠进行对比研究，APOE对照小鼠的视网膜功能降低，与早期AMD表型一致，可作为AMD研究模型。实验设计是5个月时，在饮用水中加入二甲双胍（0.4 g/kg/天）或海藻糖（3 g/kg/天）给WT 和 APOE 小鼠，而对照组只接受饮用水。13 个月时，对 (A-B) RPE 和 (C-D) 视网膜样本，采用Digital WB分析LC3B 表达水平，GAPDH作为上样对照。作为溶酶体自噬过程中标志物，LC3-II:LC3-I 比率动态变化可反应自噬过程中生成和降解的动态过程。结果揭示了APOE 小鼠的 LC3-II:LC3-I 比率较高，表明自噬减慢。但用海藻糖或二甲双胍治疗的 APOE 动物中，LC3-II:LC3-I 比例恢复到 WT 水平，增强了自噬作用。参考下图：      免疫组织化学实验结果也显示光感受器和视网膜色素上皮 (RPE) 中 MAP1LC3B/LC3（微管相关蛋白1轻链-3β）和 LAMP1（溶酶体相关膜蛋白 1）标记减少，这与增加的LC3-II:LC3-I 比率和多个自噬途径中蛋白质表达改变相关，表明自噬减慢。用二甲双胍或海藻糖处理 APOE 小鼠可改善视网膜功能丧失，增强眼组织中 LC3 和 LAMP1 表达，并将 LC3-II:LC3-I 比率恢复到 WT 水平。      通过Digital WB检测小鼠RPE和视网膜中LC3-II和LC3-I蛋白表达水平变化。LC3-II和LC3-I是小分子蛋白质，由于带电基团修饰，分子量大的LC3-II在电泳分离时，会留在更小分子量处。由于两个蛋白分子量差异仅有2kD，传统WB分析有技术难点，采用Digital WB可分析微量样本和小分子量蛋白质的优势，满足视网膜样本中小分子量膜蛋白质分析需求。非人灵长类动物模型案例1：美国AGTC公司利用Digital WB检测NHP体内转基因目的蛋白表达水平      干性年龄相关性黄斑变性（Dry age-related macular degeneration, dAMD）约占AMD病例的80%~90%，主要有玻璃体疣和视网膜色素上皮异常改变，疾病进展相对缓慢。dAMD致病机制尚未明确，可能与炎症、细胞退化与萎缩、氧化应激、脂质代谢障碍等多种因素相关，其治疗方案极其有限。目前临床阶段研发药物主要以靶向补体系统、氧化应激和炎症反应相关机制为主。近年研究发现，编码关键补体调节因子CFH（The Complement factor H）和CFI (The Complement factor I）的基因遗传突变与干性AMD的发生和发展密切相关，这些蛋白质天然调节补体系统以维持平衡。CFH编码蛋白质H因子是补体旁路激活途径中起重要作用的负调控因子，可调控降低炎症反应减缓dAMD发展。      美国AGTC公司采用新颖设计，将编码CFH的20个短重复序列缩减为18个，这个新型CFH变异体称为tCFH，已在小鼠模型上完成概念验证，并在体外实验中证明了其具有与野生型CFH相同生物活性。在非人类灵长类动物（NHP）上进一步研究体内活性，采用Digital WB检测NHP模型上RPE和视网膜的CFH和tCFH表达水平，采用AAV载体携带变异体基因可在体内实验中实现缩短补体因子表达，本项目已在准备IND申报中。      美国Spark therapeutics公司发表了AAV载体基因治疗庞贝病（PD）临床前小鼠和非人灵长类动物（NHP）最新研究成果(Nature Communication, 2021），采用Digital WB检测血浆中hGAA转基因蛋白表达。Digital WB技术可用于非人灵长类动物模型中样本检测，评估眼科疾病基因治疗项目中转基因目的蛋白质表达水平，评估疗效。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具      Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。      Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献： Gordon, Kathleen; Del Medico, Amy; Sander, Ian; Kumar, Arvind; Hamad, Bashar (2019). Gene therapies in ophthalmic disease. Nature Reviews Drug Discovery.MacLaren, R.E. A 2020 vision of ocular gene therapy. Gene Ther 28, 217–219 (2021).基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）Thilo M. Buck and Jan Wijnholds. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4197.Annemieke Aartsma-Rus, Jennifer Morgan, et at. Report of a TREAT-NMD/World Duchenne Organisation Meeting on Dystrophin Quantification Methodology. Journal of Neuromuscular Diseases. 6 (2019) 147–159Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA (2018) Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS ONE 13(4): e0195850.Matynia A, Wang J, Kim S, Li Y, Dimashkie A, Jiang Z, Hu J, Strom SP, Radu RA, Chen R, Gorin MB. Assessing variant causality and severity using retinal pigment epithelial cells derived from Stargardt disease patients. Transl Vis Sci Technol. 2022;11(3):33Zhang W, Frausto R, Chung DD, et al. Energy shortage in human and mouse models of SLC4A11-Associated corneal endothelial dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020;61(8):39Brooks et al., Improved Retinal Organoid Differentiation by Modulating Signaling Pathways Revealed by Comparative Transcriptome Analyses with Development In Vivo, Stem Cell Reports (2019)Arifa Naeem, etc. RetGC-GUCY2D retinal organoid disease model for AAV gene therapy development.  MeiraGTx LTd

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

      自1986年第一个治疗性单克隆抗体（mAb）获批以来，mAbs已经成为发展最快的药物。超过80种mAb药物已被批准用于治疗，目前还有更多的mAb正在开发中。对mAbs药物开发至关重要的是对其分子量大小和电荷变异体进行表征。分子的异质性会影响mAb药物的稳定性、有效性和安全性。      传统方法表征分子量大小异质性是通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。然而，SDS-PAGE具有操作繁琐和重复性差的缺点。十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（CE-SDS）作为一种高分辨率、高精确度和高度自动化的分析方法，在分析mAbs时，其精确度、线性、重复性和分辨率方面远远优于SDS-PAGE。CE-SDS可以实现非糖基化重链（NGHC）的精确定量。抗体药物的NGHC直接影响其生物功能。NGHC含量是抗体药物质量控制的一个关键指标，CE-SDS方法比SDS-PAGE有更好的分辨率来量化NGHC。      根据ICH（国际人用药品注册技术协调会）指导原则，2018年，全柱成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF）技术已经被中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）联合国内8家不同公司，共计10个实验室进行了联合验证（Gang, Wu, Chuanfei, et al. Interlaboratory Method Validation of icIEF Methodology for Analysis of Monoclonal Antibodies[J]. Electrophoresis, 2018.），用以定量监测和表征电荷异构体，但CE-SDS尚未进行。为了满足制药行业对CE-SDS方法标准化的需求，并方便不同品牌毛细管电泳设备（CE）和不同实验室之间的方法转移和方法重现，2021年NIFDC进行CE-SDS方法联合验证，涉及13家公司的13个实验室，使用四种不同型号毛细管电泳设备。该验证遵循ICH指导原则，利用一种商业mAb药物，考察验证仪器的精密度、线性、定量限和准确度等内容。表1. 该项研究参与者和仪器型号      四种类型仪器的电泳图见图1。所有电泳图都含有明确的峰，还原状态下的轻链（LC）、非糖基化重链（NGHC）和重链（HC），同时还观察到五个杂质峰（标记为P1-P5）。在非还原条件下的电泳图中，除主峰外还观察到六个尺寸异构体相对应的峰（标记为P1-P5，在一些运行中还观察到P6）。然而，在四种类型仪器的电泳图中没有观察到比P1-P6更多的杂质峰。杂质的一致性在四种类型的仪器中显现出来。图1. 四种类型仪器电泳图重复性      分为进样精密度和样品制备重复性。进样精密度主要反映了仪器和方法中使用的试剂的变化。而样品制备重复性除了反映仪器的变化外，还反映了操作者误差的差异。如图2和图3所示，当排除CE9这个异常值后，两组数字有相同趋势（95%置信区间）。在进样精密度方面，12台仪器的杂质百分比范围为3.5-4.6%，单体95.5-96.5%，NGHC 1.0-1.3%，LC+HC总计97.5-98.0%；而在样品制备重复性方面，12台仪器的杂质百分比范围为3.4-4.3%，单体95.7-96.6%，NGHC 1.0-1.3%，LC+HC总计97.3%-98%。这些数值表明，在该方法中操作者的误差影响最小。图2左.  13台仪器在非还原和还原条件下的进样精密度；图3右.  13台仪器的样品制备重复性批间精密度      每个实验室进行3天实验。在样品制备后，在不同日期使用不同的毛细管，每天进样一次。结果见图4。该测试反映了仪器在多天内的变化。12台仪器（CE9仍是一个异常值）的测试变化范围与重复性测试相同：在95%的置信区间内，12台仪器的杂质百分比范围为3.5-4.3%，单体95.7-96.7%，NGHC 1.0-1.3%，LC+HC总计97.2-98.0%。图4.  13台仪器的批间精密度准确度      在0.5、0.75、1.00（目标样品浓度）、1.25和1.50 mg/mL五种不同的样品浓度下，测定了四种成分的回收率，即非还原条件下的杂质（P1-P6峰）和单体；还原条件下的NGHC和LC+HC总量。对于所有仪器来说，四种成分的三次进样（N=3）回收率都在预先设定的回收率标准（83-117%）之内，除了CE4，其回收率在总蛋白浓度为0.5mg/mL时为81%，而且只在非还原条件下。该方法对其预期的应用目标来说是准确的。见图5图5.  在非还原和还原条件下，13台仪器样品中四种成分的回收率线性      对于非还原和还原条件下的主要成分（单体和LC+HC总量），所有仪器的R2对于LC+HC来说都>0.94，对于单体来说>0.96。对于次要成分，它们的R2比主要成分小，这是预料之中的。见表2和表3表2. 单体和杂质（P1-P6）在非还原条件下的线性拟合表3.  HC+LC总量和NGHC在还原条件下的线性拟合定量限      13台仪器中每台仪器在非还原和还原条件下的LOQ，如表所示，在非还原CE-SDS中为0.46%，在还原CE-SDS中为0.14%。见表4表4.  13台仪器在非还原和还原条件下的LOQs样品稳定性      样品在非还原和还原条件下被变性，在仪器的样品盘中存放24小时。除了CE4在非还原条件下24小时后显示出较高的杂质峰面积百分比外，所有仪器在0小时和24小时之间的四个组分峰面积百分比的差异都在重复性测试结果的范围内。见图6图6.  样品中四种成分的溶液稳定性结论      研究结果证明，CE-SDS方法符合其预期的应用目的--对于mAb治疗药物的纯度和大小异质性特征检测，该研究的结果减轻了CE-SDS方法开发和方法转移的负担，因为使用任何一种仪器的CE-SDS方法都呈现出预期的重现性、准确性和LOQ。Maurice全自动蛋白质表征系统采用免组装毛细管卡盒设计与创新性实时全柱成像等电聚焦专利技术，同时具备CE-SDS和iCIEF两种检测模式，双模式符合2020版中国药典。ProteinSimple，Meet Maurice | ProteinSimple 全自动蛋白质表征系统--全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术 · 双模式（CE-SDS&iCIEF） · 双通道（紫外&荧光） · 免组装毛细管卡盒 · 快速表征视频号

      遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。在非临床研究和临床研究中，检测转基因目的蛋白表达是基因疗法开发的一个关键方面。      目前，有多种技术可实现目的蛋白表达定量检测包括配体结合法(Ligand binding assay，LBA)如酶联免疫吸附方法（ELISA）、液相色谱-质谱（LC-MS）、流式细胞术、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和组织染色技术。每种技术都有各自优势和局限，如目的蛋白为分泌性表达，可采用ELISA方法检测细胞培养上清液或体液系统中目标蛋白含量；如目的蛋白不能分泌表达，可采用Western Blot或质谱方法；如需要检测细胞膜蛋白，可采用流式细胞术；如要确定蛋白质在细胞和组织内分布，可采用免疫荧光检测。      在体内和体外模型中研究基因治疗产物与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。眼部疾病细胞模型案例1：iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）中低丰度大分子量蛋白质表达检测      从三名Stargardt病人皮肤活检样本产生多个iPS细胞系，这些患者都携带一个致病性ABCA4基因变异。采用RNA-Sep和Digital WB分析正常对照和患者细胞衍生的RPE。这个细胞模型与活检组织相比，可用于评估难以检测的非表达变异体，患者来源的细胞可能更密切地反映患者体内发生的剪接和编辑事件，可用于病人药物敏感性研究，指导临床试验。采用全自动Digital WB技术分析pABCA4蛋白质表达，制备了20 μg 总蛋白 dRPE 细胞匀浆，阳性和阴性对照分别是20 μg野生型和 ABCA4 敲除小鼠视网膜匀浆。参考下图，小鼠视网膜（Mouse ret）在野生型(WT)中pABCA4表达丰度很高，敲除（KO）小鼠没有表达。人类对照（NHDF）具有比WT小鼠视网膜更高表观分子量，同时有更高的表达丰度。与对照相比，所有患者细胞系（H、J和S）中均可检测到pABCA4 ，但这些低丰度pABCA4蛋白可能被降解，作为截短蛋白或降解产品形式存在（除S2外）。与mRNA表达谱结果一致，S2细胞系具有相对正常的pABCA4表达水平和修饰后成熟膜蛋白的分子量。本研究利用了Digital WB对低丰度和大分子量蛋白质分析检测能力。案例2：眼角膜内皮细胞信号通路中多重蛋白质表达检测      本研究采用人源和鼠源细胞，分别是敲低了SLC4A11表达水平的原代人角膜内皮细胞（primary human corneal endothelial cells, pHCEnC），即SLC4A11 (SLC4A11 KD pHCEnC)；还有Slc4a11+/+和Slc4a11-/-鼠角膜内皮细胞系（murine corneal endothelial cells, MCEnC），即 Slc4a11-/- MCEnC和Slc4a11+/+ MCEnC。比较转录组学分析揭示了SLC4A11 KD pHCEnC和Slc4a11-/- MCEnC中细胞代谢和离子转运功能抑制以及线粒体功能障碍，导致ATP生产减少。AMPK-p53/ULK1通路激活也表明线粒体功能障碍和线粒体自噬。稳态 ATP 水平降低和随后 AMPK-p53 通路激活提供了代谢功能缺陷和转录组改变之间的联系，以及 ATP 不足以维持 Na+/K+-ATPase角膜内皮泵的证据，这是 SLC4A11 相关角膜内皮营养不良特征性水肿的原因。所以SLC4A11缺陷角膜内皮中分子作用导致内皮功能障碍，是先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED) 和Fuchs 角膜内皮营养不良的主要特征。      下图结果表明SLC4A11缺陷角膜内皮中AMPK-p53 通路激活，采用Digital WB检测信号通路中各蛋白质表达水平。图B说明与 scRNA pHCEnC 对照相比，SLC4A11 KD pHCEnC 中 p53 Ser15 磷酸化水平增加，表明p53转录翻译后激活。图C在Slc4a11-/- MCEnC晚期传代中观察到相似结果（p53 Ser18磷酸化增加，对应于人p53 Ser15）。图C和D结果表明在Slc4a11-/- MCEnC 早期和晚期传代中总 p53 水平增加，代表p53转录激活。进一步研究磷酸化和p53转录激活的激酶，根据报道AMPK介导 Ser15（小鼠中Ser18）磷酸化和p53转录激活，图B和C实验结果也说明AMPKα的Thr172磷酸化增加，AMPKβ1的Ser182磷酸化没有变化。图E和F，与 scRNA pHCEnC 相比，AMPK 另一种下游底物 Unc-51 样自噬激活激酶 1 (ULK1) 在SLC4A11 KD pHCEnC中磷酸化水平(Ser555)增加。综合这些结果表明，ATP水平下降导致AMPK及其下游底物p53 和 ULK1 激活，分别导致转录组改变和线粒体自噬增加。同样，鉴于 SLC4A11 在预防氧化损伤中的作用，SLC4A11 缺失导致线粒体 ROS 产生增加，随后线粒体功能障碍和线粒体自噬增加。此发病机制支持使用Slc4a11-/-小鼠作为SLC4A11相关角膜内皮营养不良的模型，评估各种治疗方法的转化潜力。      基于Digital WB技术的全自动蛋白质表达分析系统Jess可实现化学发光和荧光两种检测模式，是多重蛋白质表达分析有力工具。2022年，ProteinSimple发布了Stellar全自动双色荧光蛋白质表达检测方案，特别适合同步分析细胞信号通路磷酸化蛋白和总蛋白表达，将细胞信号通路研究工具带到一个新高度。iPSC衍生视网膜类器官模型案例1：Digital WB检测iPSC衍生的视网膜类器官中视紫红质表达含量      美国NIH研究人员利用成纤维细胞重编程获得诱导多能干细胞（iPSC），再分化产生视网膜类器官。通过转录组学分析，确定了视网膜类器官发育过程中调节信号，在体外生成了更成熟视网膜，可促进疾病建模和基因治疗研究。本研究采用Digital WB技术揭示了不同培养条件下类器官培养物种视紫红质（Rhodopsin）表达差异。下图结果表明，DHA处理的类器官在32天时视紫红质表达增加了30%，而亚油酸（LA）处理类器官视紫红质表达降低，这表明DHA处理的类器官中视紫红质表达增加不是脂肪酸添加带来的。案例2：AAV基因治疗的RetGC-GUCY2D视网膜类器官疾病模型      Leber先天性黑蒙可由多种不同突变基因导致包括RPE65、CEP29、GUCY2D和CRX等。其中Leber先天性黑蒙1型由GUCY2D基因突变导致，可导致严重视力损害或失明。GUCY2D基因正常拷贝编码了一种鸟苷酸环化酶（RetGC），其是感光器生理学中关键酶之一，视网膜中光敏杆状细胞和视锥细胞使用该酶将光转换为电化学信号。      英国MeiraGTx公司研究人员利用CRISPR/CAS9 技术生成 RetGC 敲除 (RetGC KO) 视网膜类器官，iPSC衍生视网膜类器官分化后，将RetGC KO 视网膜类器官与同一细胞系的野生型类器官进行对比研究。总共设计了四种 AAV 载体来测试RetGC 蛋白在光感受器中的恢复情况，所有载体采用AAV7递送。CMV 和视紫红质激酶 (RK) 两个启动子，并评估了WoodChuck肝炎病毒翻译后调控元件 (WPRE) 影响。采用Digital WB检测6组类器官中RetGC蛋白表达水平。实验结果揭示，与非转导样本组比，所有载体设计均以不同效率产生RetGC蛋白。加入WPRE似乎显示出效力降低趋势，通过其他量化指标验证了这个趋势。      Digital WB相比传统Western blot，只需要几十分之一样本量就可实现类器官等珍贵样本中蛋白质定量检测，而且重复性更高和速度更快，非常适合眼部疾病类器官模型的转基因目的蛋白及相关通路蛋白表达分析。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具      Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。      Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献： Gordon, Kathleen; Del Medico, Amy; Sander, Ian; Kumar, Arvind; Hamad, Bashar (2019). Gene therapies in ophthalmic disease. Nature Reviews Drug Discovery.MacLaren, R.E. A 2020 vision of ocular gene therapy. Gene Ther 28, 217–219 (2021).基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）Thilo M. Buck and Jan Wijnholds. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4197.Annemieke Aartsma-Rus, Jennifer Morgan, et at. Report of a TREAT-NMD/World Duchenne Organisation Meeting on Dystrophin Quantification Methodology. Journal of Neuromuscular Diseases. 6 (2019) 147–159Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA (2018) Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS ONE 13(4): e0195850.Matynia A, Wang J, Kim S, Li Y, Dimashkie A, Jiang Z, Hu J, Strom SP, Radu RA, Chen R, Gorin MB. Assessing variant causality and severity using retinal pigment epithelial cells derived from Stargardt disease patients. Transl Vis Sci Technol. 2022;11(3):33Zhang W, Frausto R, Chung DD, et al. Energy shortage in human and mouse models of SLC4A11-Associated corneal endothelial dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020;61(8):39Brooks et al., Improved Retinal Organoid Differentiation by Modulating Signaling Pathways Revealed by Comparative Transcriptome Analyses with Development In Vivo, Stem Cell Reports (2019)Arifa Naeem, etc. RetGC-GUCY2D retinal organoid disease model for AAV gene therapy development.  MeiraGTx LTd

            重组人红细胞生成素（rhEPO）是全球最重要的生物制品之一，可用于治疗由慢性肾脏病、肿瘤化放疗或骨髓增生症导致的贫血。rhEPO是一种高度糖基化的糖蛋白药物，几乎rhEPO分子量的一半是由翻译后修饰的多糖组成。这些多糖包括N端链接寡糖链，其末端为唾液酸残基。唾液酸残基在控制rhEPO在体内半衰期起重要作用，并且影响其稳定性和电荷异质性。      电荷异质性（电荷变异体），即蛋白质表面电荷的改变。改变可以是由于电荷数量增减的直接改变，也可以是由于蛋白构象改变而间接引起的改变。产生电荷异质性的原因有很多，例如异构化、氧化、聚合、末端改变、脱酰胺化和糖基化等。      rhEPO电荷变异体产生最主要的原因是其高度糖基化，尤其是高度唾液酸化。电荷异质性是反应糖基化水平的重要表征之一，属于关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQA），监管机构要求必须在整个生产和贮存中对rhEPO的电荷异质性进行检测和表征。使用CZE方法表征rhEPO存在如下难点制剂中rhEPO含量相对较低，μg级别，需要浓缩样品提高检测灵敏度；制剂中含多种辅料组分，可能会对分析结果造成干扰。例如，促红素制剂中含有mg级别的人血白蛋白（HSA），使用CZE方法会对结果造成干扰；CEZ方法需对样品进行复杂前处理，去除辅料干扰。NIFDC解决方案      2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）依据ICH（国际人用药品注册技术协调会）指导原则，利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（iCIEF）自发荧光通道表征8种商品化rhEPO电荷异质性，并评估该方法的精密度、准确性、线性、范围和耐用性。      紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。而自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料，提高检测灵敏度。      结果表明，对比CZE-UV（毛细管区带电泳-紫外）方法，iCIEF方法自发荧光通道检测具有更高的分辨率和灵敏度，同时具有快速检测、无需样品前处理、消除辅料干扰等优势。结果展示图1. A：紫外通道检测  B：自发荧光通道检测      图1结果显示，紫外通道检测（A）的信号很低；自发荧光通道检测（B），可以明显看到信号增强，且各个变异体分离效果较好。表1. 紫外通道检测和自发荧光通道检测对比      研究结果表明，两种通道检测下各变异体峰面积比例含量完全一致（表1）。图2. 自发荧光通道检测不同浓度样品表2. 文献报道其它方法定量限      研究人员考察了利用自发荧光通道检测1.25μg/m至20μg/ml浓度范围内样品（图2），各变异体面积比例含量和浓度线性关系良好，R方均不低于0.99。该方法定量限（LOQ）为0.1ug/ml（表2），根据文献报道显示，本方法灵敏度为最高。图3. 不同稀释度下的回收率      研究人员配制了7个不同浓度的样品对该方法准确性进行验证（图3），通过实际测定总峰面积和理论总峰面积来计算回收率，回收率在80-105%之间。图4. 耐用性评估      研究人员对方法耐用性进行评估（图4），比较不同两性电解质浓度、尿素浓度、不同毛细管以及不同样品放置时间情况下的各变异体等电点和峰面积百分比的差异。结果表明，变异体等电点差异不超过0.1，峰面积百分比RSD%不超过5%，方法耐用性良好。图5.  自发荧光检测模式表征8种商品化rhEPO电荷变异体     为了证明该方法对商品化rhEPO表征的适用性，研究人员利用所建立方法，对不同企业的8种商品化rhEPO电荷变异体进行表征（图5）。DP1-6有相似峰型，在DP3和DP6中，有一额外明显的小峰。DP7峰形独特，可能由于与其他DP相比糖基化不同所造成。结论      NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术自发荧光检测通道建立并证明了用于rhEPO电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点：无需样品预处理，可直接表征rhEPO；自发荧光通道检测的rhEPO峰型与紫外吸收通道检测得到的峰型相同；与CZE-UV或icIEF紫外吸收通道检测相比，自发荧光检测灵敏度更高；不受高浓度辅料干扰（如人血清白蛋白和聚山梨酯，会干扰CZE分析，CZE 分析前，须通过多步分离步骤去除这些辅料）；该平台方法快速且操作简易。扫描下方二维码，获取ProteinSimplerhEPO表征解决方案参考文献：1. Li, Xiang et al. “Capillary isoelectric focusing with UV fluorescence imaging detection enables direct charge heterogeneity characterization of erythropoietin drug products.” Journal of chromatography. A vol. 1643 (2021): 462043.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

      “学科交叉点往往就是科学新的生长点、新的科学前沿，这里最有可能产生重大的科学突破，使科学发生革命性的变化。同时，交叉科学是综合性、跨学科的产物，因而有利于解决人类面临的重大复杂科学问题、社会问题和全球性问题。”--中国科学院院刊      细胞外囊泡（EVs）作为递送载体，已被广泛应用于生化工程学、生物医学工程学、纳米材料学、分子影像学等交叉学科中。通过交叉学科的火花碰撞，利用前沿新技术，提高疾病治疗效果，造福广大病患。本文与您分享EV递送纳米抗氧化剂等应用案例，拓展您的课题研究思路。巨噬细胞EV参与“免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动    2022年3月，深圳市第二人民医院李维平团队联合中国科学院大学化学工程学院魏炜团队共同发表题为“Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects”于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊（IF：18.19）。    被称为“终结者”的胶质母细胞瘤（GBM）是颅内神经系统最常见的恶性肿瘤。临床治疗GBM以外科手术为主，辅助放化疗，但效果收效甚微。难以穿透的血脑屏障 （BBB） 阻止药物进入中枢神经系统，使得治疗难度雪上加霜。因此，亟需更为有效的药物递送策略。     研究人员利用M1型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M1EVs），使其膜被两种疏水剂功能化：化学激发源CPPO（C）和光敏剂Ce6（C），并装载亲水缺氧激活原药AQ4N（A），构成的CCA-M1EVs可穿过BBB，并可趋化富集在GBM部位，通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境免疫调控，增加过氧化氢（H2O2）水平。H2O2和CPPO之间可进行反应，产生的化学能量进一步激活Ce6，产生大量活性氧，实现化学激发的光动力疗法（CDT）。由于该反应消耗氧气，肿瘤缺氧的加剧也导致无毒的 AQ4N 转化为有毒的 AQ4 用于化疗。因此，CCA-M1EVs在GBM中实现了免疫调控-化学动力-乏氧激活的多级联动协同作用，发挥了强大的治疗效果。     研究人员利用全自动Digital Western检测M1巨噬细胞和M1EV中CD9、CD81、ALIX、TSG101、iNOS、F4/80和GAPDH的蛋白水平（如上图b所示）。EV递送纳米抗氧化剂    2021年来自中科院过程所魏炜团队，联合上海交大医学院附属同仁医院等多家单位，共同发表题为“In situ growth of nano-antioxidants on cellular vesicles for efficient reactive oxygen species elimination in acute inflammatory diseases”于《Nano Today》期刊（IF：20.72）。     临床上常见的急性炎症疾病，有急性肠炎和急性肝损伤等等。病情严重的患者，会出现脏器功能紊乱甚至器官衰竭。急性炎症过程中，会产生大量的活性氧自由基（ROS）。ROS会引起细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜通透性改变和进一步DNA损伤，进而引起器官功能障碍。ROS大量产生是体内炎症发生发展过程中的一个重要环节，因此需要高效手段，将药物富集在炎症部位，然后消灭ROS。     纳米抗氧化剂，例如氧化铈、氧化钼和氧化锰，可借助其催化活性清除ROS，以此减少ROS引发的组织损伤，并控制疾病进展。然而，这些纳米抗氧化剂在炎症组织中的蓄积量较低。研究人员利用红细胞囊泡递送纳米抗氧化剂，效果显著。该项研究的另一亮点是研究人员将具有组织修复功能的干细胞外泌体融合（ReMeV），并在此基础上原位生长氧化铈（shi）纳米晶体（Ce-ReMeV），用于重症急性肠炎和急性肝损伤的治疗，在有效清除ROS同时，还能修复受损组织和器官，在小鼠模型上取得了满意的效果。    研究人员利用全自动Digital Western检测外泌体 Marker（CD9）、外泌体和红细胞Marker（TSG101、HSP70）以及MSC生长因子（HGF）（如上图c所示）。每个样品仅需3μL。全自动Digital Western，为何备受大家的喜爱？      传统Western Blot（WB）属于劳动密集型技术，时间长、步骤冗长、人为操作引入过多误差，最终导致数据质量低......最重要的是实在太影响心情！图片取材于网络      全自动Digital Western技术平台的横空出世，一扫传统Western带给广大科研工作者的阴霾，每一天都是做WB的良辰吉日，让您从此享受WB！节省出大量宝贵时间去专注于阅读、思考、交流、仰望天空、参与社团、思考人性、（校园恋爱）等更有价值的事务。全自动Digital Western检测全流程（上样后，剩下的一切都交给她，一顿晚饭的功夫拿到结果）      全自动数字式Western，带给您的仅仅是3 μL超微量的上样量？3小时出结果？全程自动化标准化？更重要的是真正数字化的高质量数据和全膜结果，让您的数据不被质疑！撤稿？不存在的！扫码索取全自动Digital Western产品资料解放双手，从此爱上WB，告别实验Emo！

      蛋白新药的设计得益于重组DNA技术的发展。融合蛋白是指通过基因融合两个或更多蛋白质结构域来创造一个具有新功能的嵌合蛋白。每个融合体的功能通常分为一个载体结构域和一个效应结构域，前者有助于提高稳定性和药代动力学，后者具有从细胞毒性到识别和结合等不同的功能。截至2019年，已有11种Fc融合蛋白疗法被FDA批准。      生物制药的电荷变异体（电荷异质性）来自翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和脱酰胺化，须在整个生产过程中密切监测，因为它可能影响产品的安全性和有效性。全柱成像毛细管等电聚焦（icIEF）已被证明有诸多良好检测性能特征，如高分辨率、自动化、定量准确、重现性好和易用性。凭借这些优势，它已成为生物制品，特别是单克隆抗体电荷变异体表征的主流技术。      与单克隆抗体等传统生物药相比，融合蛋白的电荷异质性差异更大，这使得表征融合蛋白成为一个挑战。建立一种适用于分析多种融合蛋白的平台方法可以方便方法开发并且简化生产流程。2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术的双通道（紫外&自发荧光）表征9种融合蛋白药物的电荷异质性，其中6种蛋白为商业化蛋白。紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料。      结果表明，icIEF方法可用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析。该方法快速、准确、重复性好，为保障融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种可靠的平台分析方法。9种融合蛋白9种融合蛋白治疗剂（在本研究中被命名为样品1-9），其中6种已商业化，包括：样品1：安进公司的依那西普；样品2：百时美施贵宝公司的阿巴泰普；样品3：再生元公司的阿夫利贝特；样品5：重组人肿瘤坏死因子-α受体II：海正药业的IgG Fc融合蛋白；样品6：嘉宏药业的康柏西肽；样品7：百时美施贵宝的贝拉塔塞普；三个样品正处于不同临床试验阶段，包括VEGFR-Fc融合蛋白样品4，血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白样品8和胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白样品9。结果通用稳定剂SimpleSol      大多数融合蛋白在传统电聚焦凝胶电泳（IEF）分析过程中会聚集或沉淀，需要添加剂来保持稳定性。尿素已被证明可以减少蛋白质聚集，并提高IEF分析的重复性。因为本研究的目的是开发一个平台方法，所以需要确定一种能在多种融合蛋白中发挥作用的稳定剂。为此，研究人员比较了尿素和商业稳定剂SimpleSol（来自ProteinSimple）对三种不同的融合蛋白治疗剂（样品1-3）的影响。      在没有稳定剂的情况下，样品1在电泳分析过程中发生聚集，形成不可重复的峰型（图1）。在加入2M尿素的情况下，样品1的峰型重复性得到提升。然而，在有尿素的情况下，峰高明显降低，约为无尿素情况的25%。相比之下，当样品1在含50%的SimpleSol的体系下进行分析时，峰型变得可重复，而且峰高和分辨率都保持不变（图1）。因此，对于样品1，SimpleSol比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。图1      对于样品2，在没有添加稳定剂的情况下也观察到了聚集现象，导致了峰型的不可重复（图2）。与样品1不同，加入2M尿素并没有改善峰型的分离。只有当加入4M尿素时，峰型才变得可重现。然而，在这两种条件下，峰高和分辨率也都明显降低。在SimpleSol的存在下，峰高和分辨率都得到了保持（图2），再次证明SimpleSol在稳定样品方面优于尿素。对于样品2，SimpleSol同样比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。数据表明，SimpleSol可以作为一种通用的蛋白质稳定剂用于融合蛋白的icIEF分析方法。图2紫外吸收和自发荧光双通道检测      在紫外吸收检测模式下研究人员分析样品1，样品峰从嘈杂的基线中区分不明显（图3）。为了克服这一挑战，研究人员同时利用自发荧光通道检测。与紫外吸收检测相比，荧光检测的每个峰组都显示出更高的信号，并且荧光检测的基线噪音更小。图3与传统IEF方法对比      icIEF方法与平板凝胶IEF方法产生了相似的峰型（图4）。然而，icIEF方法的每个峰的分辨率均得到了改善。此外，icIEF方法的灵敏度明显高于IEF方法；在获得凝胶IEF结果时，每个泳道要上样大约20μg的蛋白质，而利用icIEF分析时，最终样品溶液进样浓度为0.225μg/μL至0.45μg/μL。每次进样量约为5μL。相当于2.25μg-4.5μg的蛋白质，极大节约了样品。图4. icIEF方法与平板IEF方法检测融合蛋白对比图总结      NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术建立并证明了用于融合蛋白电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点： 使用了通用的蛋白质稳定剂SimpleSol，可以有效避免融合蛋白发生聚集或沉淀。对于一些样品，无需任何添加剂就能获得可重复峰型，与没有稳定剂的相同蛋白质的峰型相比，添加这种稳定剂对蛋白质的峰型的不利影响很小。使得该方法可以广泛用于分析多种融合蛋白，而不需要根据不同的样品更换稳定剂。同时可通过紫外和自发荧光双通道来检测蛋白质。自发荧光检测模式利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现且无需染料，可以提高灵敏度，减少由载体两性电解质引起的背景噪音。通过icIEF分离得到的每个峰组分的峰面积百分比和表观pI值，重复性好。总共对9种融合蛋白药物进行表征，每个组分的峰面积百分比和表观PI值的定量分析都有极佳的重复性。扫描下方二维码，获取ProteinSimple融合蛋白表征解决方案参考文献：1. Wu, Gang et al. “A platform method for charge heterogeneity characterization of fusion proteins by icIEF.” Analytical biochemistry vol. 638 (2022): 114505.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

      重组AAV载体（rAAV）已经成为使用最广泛的基因治疗病毒载体之一，由于载体本身结构和生产工艺复杂性，没有合适标准品作为对照，在研发阶段、临床前动物和临床病人阶段，准确标准化定量不同研究人员和实验室病毒载体剂量一直是主要问题。Tony Hitchcock等（BioProcess International, 2017）说明了由于AAV载体异质性，导致能感染目的细胞并转导表达目的蛋白的病毒量很少，下图说明只有小比例细胞可完成有临床价值的目的蛋白表达。      临床前和临床研究重要前提是病毒含量准确检测，作为AAV基因治疗开发中的关键质量属性，准确检测病毒含量需要从不同维度和采用多种分析方法来评估。病毒生物功能学检测主要是通过感染培养的细胞，重组基因组在细胞内复制或转导的目的异源基因表达，这两种类型检测分别为感染性或病毒转导滴度。相反，物理方法不依赖于病毒的生物学功能，病毒DNA通过衣壳消化酶处理后提取，常规的检测技术是qRCR和数字PCR，称为基因组滴度检测；对于病毒衣壳滴度检测采用ELISA方法、HPLC、SEC-MALS和NTA等技术；为了评估病毒感染的效价，必须要检测感染滴度。      D Grimm 1999说明AAV2衣壳蛋白可能引发宿主体液免疫原性反应，迫切需要检测AAV制剂中总AAV衣壳的准确数量。目前检测病毒衣壳滴度最普遍采用传统孔板ELISA实验，特别是PROGEN公司开发ELISA检测试剂盒。但是这些ELISA方法动态范围窄、手动操作步骤多、耗时长和不易标准化，行业都在开发更快速、重复性更好和通量更高的检测方案，自动化检测方案为病毒衣壳检测领域铺平了道路。      Bio-Techne公司旗下ProteinSimple为了加速AAV衣壳滴度分析，利用PROGEN公司经过严格验证金标准抗体，结合全自动微流控ELISA技术平台Ella，成功开发了AAV自动化快速检测试剂盒。目前广泛使用的血清型是AAV2，可靶向眼、肾和中枢神经系统等组织。Ella AAV2检测方案可检测AAV2病毒生产过程中衣壳完整的AAV2滴度，将双抗体夹心ELISA法和Ella微流控技术结合，实现了AAV2病毒衣壳滴度的自动化快速可重复检测。1Ella自动化操作流程对比手动ELISA，可减少80%手动操作时间和人员投入（15min VS 80min）2Ella ELISA实验具有更宽动态检测范围，可适用于各种不同工艺阶段的样本浓度测试要求3自动化实验检测具有更高数据精密度，适合不同实验室和不同时间点实验数据对比研究对比PROGEN传统手动ELISA，Ella自动化方案总结      以上技术对比可说明，与传统ELISA方法比，在操作复杂、费时和重复性差等方面Ella都有明显提升，其检测方案具有更高自动化程度，具有更宽检测范围，可更快速获得实验结果。特别适合AAV病毒载体工艺优化和CMC生产过程中衣壳滴度检测，而且Ella软件符合21 CFR Part 11，安全性高，符合GMP要求。      除AAV2自动化快速检测方案外，Ella已经成功开发HEK293 HCP自动化检测方案，致力于实现AAV基因治疗产品的工艺和质控测试自动化。扫码获取AAV衣壳滴度自动化标准化分析方案ProteinSimple，Meet Ella | ProteinSimple 全自动微流控免疫分析仪 · 全自动 · 高灵敏 · 高精度 · 快速视频号

国家食品药品检定研究院(NIFDC)和烟台大学药学院等科学家在期刊Journal of Pharmaceutical Sciences发表文章：Subvisible Particle Analysis of 17 Monoclonal Antibodies Approved in China Using Flow Imaging and Light Obscuration.文章中，使用光阻法(LO)和微流成像颗粒分析技术（MFI）分析了来自国内批准的17种商业单抗隆抗体药物中，205个样品的亚可见颗粒。每种方法进行了633次测试。在测试中，冻干粉或注射器包装的样品具有显著更高的颗粒浓度，且MFI的颗粒计数通常高于LO计数。通过研究数据表明，LO无法检出蛋白质半透明颗粒的数量是MFI方法高于LO计数的原因。研究背景基于单克隆抗体（mAb）生产工艺的复杂性，因此需要对其关键质量属性(CQA)进行控制和监测，同时为了确保药物产品的安全性和有效性，还需证明CQA在生产过程的一致性。这些CQA包括可见颗粒（VPs）和亚可见（SVPs）颗粒的测量。然而过去并没有对治疗蛋白质产品中的亚可见颗粒（0.1-100μm）的颗粒进行积极的检测。有研究表明，治疗性蛋白质产品中的蛋白质有聚集并形成SVPs的倾向，且这种聚集会引起治疗效果的降低和潜在的免疫原性风险。欧洲药典(EP)2.9.19、美国药典(USP)和中国药典(ChP)0903等药典专论中对SVPs进行颗粒计数限值。且USP建议使用4-100μm粒径范围内的形态测量，这可能有助于理解粒子来源为固有的、内在的/外在的，以降低SVPs带来的风险。光阻法(LO)是USP规定的主要检测方法，用于量化两个尺寸范围（≥10μm和≥25μm）的SVPs。该技术确定了颗粒的大小和数量，但由于其检测原理，无法区分不同类型的颗粒，例如蛋白质聚集体、硅油液滴等。许多研究表明，LO可能无法检测到半透明的蛋白质聚集体，从而低估了样品中的总颗粒。也有一些报告表明，样品的折射率(RI)会影响LO结果。随着USP和USP的发布，要求在计数/浓度和形态方面表征2-10μm的SVPs。流式成像显微镜(FIM)技术已成为量化与LO技术相同大小范围内的SVPs的替代方法，它可以检测半透明的蛋白质聚集体，即通过使用直接对颗粒进行成像的FIM，还可以获得形态信息。这使得该技术能够将蛋白质聚集体与其他颗粒（如硅油滴、气泡和其他外在和内在的颗粒杂质）区分开来。本文中FIM技术使用的是ProteinSimple的微流成像颗粒分析技术（MFI）。到目前为止，比较这两种技术的研究都使用了标准微珠、蛋白质模拟物或有限数量的治疗性mAb样品。但没有对多批不同的商业治疗性mAb进行并排比较。在本研究中，使用LO和MFI方法分析了17种国家药品监督管理局批准的mAb药物产品。通过分析200多批mAb商业药物产品提供了一个独特的数据集，以检验MFI法和LO方法之间的粒子数计数差异和二者关联。样品准备表1列出了17种生物制药mAb药物产品的清单。对于每种药物产品，最多可获得50个批次。不同批次的相同药物被视为研究中的不同样本。对于药物的不同批次，它们分别标有数字1、2、3等。因此，研究中共有205个样品，如表1所示。每个批次由LO和MFI测试3到9次。总共对205个样本使用两种方法进行了1266次测试（633次使用LO方法，633次使用MFI方法）。研究结果如图所示，对使用MFI和LO测量的205个样品的颗粒计数进行了分析。由于颗粒形成是从较小尺寸到较大尺寸的动态过程，且USP要求对2-10μm颗粒进行表征（因为这个尺寸范围可能具有免疫原性）。所以使用MFI和LO检测了≥2μm、≥5μm、≥10μm的颗粒计数，以及2-10μm的颗粒计数。结果显示，在205个样本的633次运行中，22个样本的运行子集显示LO计数高于MFI计数。对于其余样本，MFI方法的计数高于LO方法。从结果中可以看出，来自注射器和冻干样品的样品在所有尺寸范围内的颗粒计数都明显高于瓶中液体。特别是在≥2μm尺寸范围内，根据之前的报告，硅油滴可能是这个尺寸范围内高计数的主要贡献者。2-10μm尺寸范围的计数与≥2μm尺寸范围的计数具有非常相似的趋势。这是因为粒子数的多少由较小的粒子数支配。冻干形式的药品在重构时可能会形成气泡，蛋白质容易吸附到气泡从而形成蛋白质颗粒。根据早期研究，MFI方法优于LO方法的一个优势是MFI比LO方法可以检测到更多的半透明蛋白质聚集体。因此，与LO方法相比，MFI方法通常检测到更多蛋白质溶液中的颗粒（如上图所示）。为了验证MFI方法在检测半透明蛋白质聚集体方面优于LO，首先需要在MFI测试获得的结果中将蛋白质颗粒与其他颗粒分开。这可以通过利用MFI软件对粒子的各种尺寸、形态和图像强度信息等不同范围的参数来区分不同类型的粒子。利用参数的组合充当过滤器以分离样品中的蛋白质和其它颗粒。例如参数AR反映了粒子的圆度，AR=1表示正圆，ARLO 和MFI检测了单个样品药物Atezolizumab的5个批次。结果显示，两个计数方法在所有运行中都相对一致，MFI的计数略高。对于药物 Daratumumab，如图B所示，在11个批次中，两个计数方法对于大多数运行来说都是一致的，其中一个批次的MFI计数要高得多。通过应用过滤器，可以确定MFI计数高的原因是蛋白质颗粒的计数高。从以上两个例子中可以看出，在同一种药物中，不同批次的颗粒计数MFI和LO方法的结果一般是一致的，MFI计数略高于LO计数。有几个批次具有较高的MFI计数，这是由于高计数的蛋白质颗粒引起的。不同批次的相同药物的蛋白质颗粒计数可能不同。图C显示了来自注射器包装的两个Golimumab样品的计数。6次运行中的蛋白质颗粒计数是一致的，而非蛋白质颗粒的计数在不同批次中是可变的。大量MFI计数高于LO计数，主要原因是蛋白质颗粒计数高。这也证实了早期的研究。对于这种药物，在所有6次运行中，非蛋白质颗粒的趋势和LO的总计数非常吻合。为了确定使用MFI观察到的更高计数是否与半透明蛋白质聚集体的数量有关。因为在示例中，从总MFI计数中分离出的非蛋白质颗粒计数接近LO计数。因此需要比较MFI的总计数与LO的计数以及MFI的计数与LO的非蛋白质部分之间的相关性。首先，将所有270次MFI运行中≥5μm的MFI计数与LO计数作图，相关性较低（图A）。当将MFI计数的非蛋白质颗粒与总LO计数作图时，相关性显著提高（R2从0.781到0.933），这表明蛋白质、半透明颗粒的数量是导致MFI计数高于LO的主要因素。因此证实了MFI在检测蛋白质半透明颗粒方面优于LO。结  论本研究使用LO和FIM方法测量了来自17种商业mAb药物产品的205个样品（批次）中≥2μm、≥5μm、2-10μm、≥10μm的SVPs。结果显示，冻干粉或注射器包装状态的样品显示出明显更高的颗粒浓度，尤其是在≥2μm尺寸范围内的颗粒计数。且MFI粒子计数通常高于LO计数（205个样本中的183个样本）。通过使用AR MFI显示药物中的某些批次具有显著高的颗粒计数，被证实是由大量蛋白质颗粒引起的。同时，与瓶装液体相比，注射器的颗粒计数最多可高出10倍，瓶装液体主要归因于非蛋白质颗粒，主要是硅油液滴。MFI方法计数升高的原因是蛋白质、半透明颗粒而导致。将MFI的总计数与LO的总计数作图，并将MFI计数的非蛋白质部分也与LO的计数作图。结果相关性有很大改善。结果表明，与LO方法相比，蛋白质半透明颗粒的数量是MFI方法计数升高的主要因素。以上表明，虽然LO方法是被广泛接受的微粒分析工具，但它不足以测量生物制药中的所有粒子，证明了MFI等正交工具的必要性。由于MFI的优势，可以开展实验室间验证研究，以测试将MFI技术引入mAb的释放控制和稳定性研究的可能性。因此目前药典对SVPs的要求可以通过MFI等新技术的应用进行优化。获取资料请扫二维码

生物制药如治疗性蛋白质、疫苗、基因与细胞治疗是一个不断快速增长药物领域。生物制药原料药和药品中蛋白质聚集体和不溶性颗粒是需要充分评估和控制的杂质，因为它们有可能引发免疫原性反应，影响产品的安全性和有效性。中美药典中现行的颗粒定义是10-100 nm为蛋白寡聚体，0.1-1 μm为亚微米颗粒/纳米聚集体，1-100 μm是亚可见颗粒/微米聚集体，>∽100 μm是可见颗粒。目前基因治疗产品亚可见颗粒分析方法可参考USP787、788和789对治疗性蛋白质注射液和眼科溶液中亚可见颗粒的规定。对于含量超过100mL容器中的治疗性蛋白质注射剂，总颗粒数≥10 μm的颗粒≤6000，对于≥25 μm颗粒≤600。  不同于治疗性蛋白质产品，基因治疗产品大多采用病毒作为载体包括腺病毒（AdV）、腺相关病毒（AAV）或慢病毒（LV）、溶瘤病毒等，所以细胞、病毒和脂质纳米颗粒等递送载体本身就是颗粒，可通过大小、形态、含量和浓度的分析技术来表征。这些基于病毒载体的基因治疗产品剂型主要是注射剂，相关质量标准可参考生物大分子药物不溶性颗粒技术要求。但由于病毒颗粒异质性和复杂性，以及对最终产品的有效性和安全性可能影响，如降低病毒的转导效率和诱发免疫原性反应等，所以需要多种不同技术和方法联合使用，实现更全面更准确的基因治疗产品颗粒表征。以rAAV载体的基因治疗产品为例，病毒颗粒本身是无包膜的，二十面体结构，直径约为25nm，可形成各种不同大小的变体和聚合形态。AAV大小变异体和聚集体可增加临床实验的免疫原性，较大的AAV聚集体在转导细胞效力方面可能降低，进而改变产品疗效。目前有多种技术来表征相关产品溶液中颗粒大小，从纳米级到肉眼可见级别，对于不同粒径大小的颗粒可采用不同技术进行分析表征。对于纳米级别颗粒，可采用动态或静态光散射（Dynamic or Static Light Scattering）、SEC-HPLC、电镜（EM）、原子力显微镜 (AFM)、分析型超速离心机（AUC）、纳米颗粒跟踪分析技术（NTA，Nanosight）和非对称流场流动分级（A4F）等；对于微米级别颗粒，可采用光阻法（LO）、微流成像颗粒分析技术（MFI）、库尔特颗粒计数（Coulter counter）等。可见颗粒可采用拉曼/红外显微镜、荧光显微镜或目测法等。可用于AAV颗粒分析的代表性方法参考下图。颗粒分类中亚可见颗粒是一种聚集形式，经历了相分离并变得不溶。多个国家药典规定注射剂亚可见颗粒物检测采用光阻法（LO）和显微计数法。其中光阻法只能计数颗粒大小和数目，不能看到颗粒形态。美国药典1787推荐了微流成像颗粒分析技术作为大小和形态表征重要的方法。同时推荐在保质期内应该评估产品中2-10 μm亚可见颗粒的范围和水平，10 μm以下颗粒总数分成两组≥2-5μm和≥5-10μm来统计。2021年中国食品药品检定研究院发表文章，详细比较了微流成像颗粒分析方法和光阻法对17种单克隆抗体的亚可见微粒分析结果，显示了微流成像颗粒分析技术在准确性方面具有优势，未来可能用于放行质量控制和稳定性研究。代表性亚可见颗粒分析方法介绍微流成像颗粒分析方法（MFI）：技术原理是待测样本在流经样本检测池过程中，在固定的检测窗口处，采用高频成像检测器动态连续检测样本中颗粒物，获取一系列的数据照片，最终通过软件对所获取的颗粒物照片进行分类和计数分析。核心技术是通过精确地控制样本检测池中的流速，配合静态的图像捕获，使相邻两次成像检测液柱无重叠，从而避免对样本颗粒的重复计数，同时需要保证85%以上样本实现了颗粒成像检测，配合全景深立体成像，保证所有检测到的颗粒都在景深范围内，实现对颗粒大小检测准确性。该方法提供了样本中颗粒真实图像的原位条件，对捕获的数字图像进行分析，实现了颗粒的可视化、计数、大小调整和表征。还可根据颗粒图像、对比度和形状，可能指示颗粒的来源和类型如蛋白聚集、硅油、气泡和纤维等。与图像数据库联合使用，可识别一些颗粒，有助于了解污染源和产品性质。与光阻法和显微计数法相比，缩短了分析时间，具有更高重复性和分辨率。满足2-10 μm范围内亚可见颗粒分析需求。光阻法（LO）介绍：被检测的液体通过专门设计的流通室，与液体流向垂直的入射光束由于被液体中的粒子阻挡而减弱，从而使传感器输出的信号变化，这种信号变化与粒子通过光束时的截面积尺寸成正比。这种比例关系可以反映粒子的大小。每一个粒子通过光束时引起一个电压脉冲信号，脉冲信号的多少反映了粒子的数量。光阻法检测颗粒范围为1∽300 μm（USP 40）。以光阻法为原理设计的微粒检测仪主要包括取样器、传感器和计算机控制的检测和数据处理系统。不同设备测量粒径范围涵盖了2∽100μm，检测粒径浓度为0∽10000个/ml，取样体积为0.2∽100 mL。符合药典对大小容量注射液和粉针剂不溶性微粒检测需求。其主要优势是可直接观察溶液中颗粒，具有大量历史数据的药典推荐方法。操作简单可进行中高通量检测。劣势是对比度低，可能会低估制剂配方中形成的不可见蛋白质颗粒，对气泡敏感，某些脱气技术会改变样本性质，更重要的只适合表征颗粒大小和分布，不能通过形态来分析颗粒。电感应区检测方法：基于库尔特原理检测颗粒，可检测0.4∽1600μm范围内的颗粒（不同商业化库尔特颗粒计数及粒度分析仪有变化）。稀释悬浮在电解液中的样本颗粒通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，从而中断电场，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。 信号响应不受颗粒类型的影响（如颜色、硬度、不透明度和折射率变化）。本技术优势不受溶液光学特性的影响，可实现单孔中高通量样本检测。劣势是需要大样本体积，需要较低颗粒浓度，有时样品必须在电解质溶液中稀释获得足够电导率，可能会改变样品性质。同样也不能提供形态学参数。显微计数法：采用光学显微镜（LM）检测和分析颗粒，光在样品上透射或反射后通过一系列透镜，直接采用目镜观测，或数码相机采集信号成像。图像分析可使用软件系统，按照一定参数对颗粒群体进行分析。优势是可直接观察溶液中颗粒，可视化计数颗粒大小和数目，并鉴别颗粒形态。可与红外或拉曼计数整合来鉴定颗粒化学组成。但劣势是人工分析费时费力和通量低，难以看到低光学对比度颗粒，自动化程度低。颗粒鉴定表征可采用傅里叶红外光谱（FTIR）显微镜、显微拉曼光谱和扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）等技术，本文不做深入论述。基因治疗产品亚可见颗粒分析案例鉴于不溶性微粒研究在生物制品中重要性，有必要深入研究病毒为载体基因治疗产品中病毒颗粒聚集体和不溶性颗粒形成原因，并找到相应的解决方案来提高基因治疗产品的研发和质量控制水平。以下案例简要说明基因治疗产品亚可见微粒分析方案。AAV生产超滤工艺中颗粒监控AAV生产过程中超滤环节将AAV浓缩并置于最终制剂配方缓冲液中，作为生产工艺中关键步骤，需要深入研究和加深对AAV载体超滤的理解。美国Voyager Therapeutics公司研究超滤膜截留分子量和操作条件对复合再生纤维素（CRC）超滤膜的通量和传输的影响，采用AAV2和AAV9两个血清型病毒载体，以及对AAV超滤行为的定量理解，并指导工艺开发。利用微流成像颗粒分析方法（MFI）研究病毒浓缩超滤工艺开发过程中产生的亚可见颗粒，当通过CRC超滤膜时，膜截留分子量和操作条件对通量影响。下图结果展示1到10μm之间颗粒采用MFI检测时存在明显差异。两个批次A和B实验，对于特定的膜批次，当处理时间较长时，亚可见微粒浓度较高。与较低TMP 6.5 psig相比，当采用更高TMP（20 psig）进行超滤时，亚可见微粒浓度降低。这归因于较低TMP下超滤时，泵通过管道和通道次数增加导致。本研究可指导超滤工艺的条件设置。MFI系统具备自动进样系统，可一次自动检测多达90个样本，非常适合AAV生产过程中工艺优化。不同渗透率RC2A膜超滤的AAV2样本的不同大小颗粒评价，上图批号Lot A样本，下图Lot B样本AAV基因治疗产品稳定性研究制剂配方中AAV长期稳定性和密封容器封闭的完整性是冷冻产品两个关键方面。为了最大限度地减少化学和物理降解，也为了长期存储和运输，AAV原料药和产品制剂通常冷冻在≤-60 °C下，有时允许产品制剂短期存储在医院的2-8°C冰箱中。在制造、贴标签和临床使用过程中会在室温和冷藏条件下发生冻融循环。除了长期稳定性外，在外暴露期间AAV的稳定性也很重要。不同AAV血清型和制剂配方差异导致这期间的稳定性也会有所不同，所以在制剂配方早期开发过程中获得数据来确认AAV在制造、贴标签和临床使用期间将保持稳定是有意义的。为了研究温度、存储时间和冻融率对AAV8和AAV9稳定性的影响，美国REGENXBIO公司研究低浓度和高浓度AAV8和AAV9病毒在五个冻融循环中，预期存储以外时间的稳定性，考察病毒关键质量属性变化情况。下图是采用数字PCR检测病毒载体基因组浓度（GC/mL），结果显示病毒效力和浓度在方法误差范围内保持稳定。采用光阻法检测亚可见微粒（Particles/mL ≥10 μm）。左边第1列是配方F1中AAV8，第2列是配方F3中AAV8。每个小图中左边一对柱状图是低浓度结果和右边一对柱状图是高浓度结果。对照组标记为Cont.和累积预期存储时间外暴露样本标记为TOIS。实验结果显示TOIS后颗粒数非常低，≥2 μm的颗粒≤78个/mL，≥10μm的颗粒≤10个/mL，≥25μm的颗粒≤2个/mL，和≥50μm的颗粒0个/mL。在本研究设定实验条件下，结果表明AAV8和AAV9产品质量属性保持在可接受范围内，稳定性适合用于生产和临床使用。作者认为光阻法有局限，可能低估了半透明的蛋白质颗粒和病毒聚集体颗粒，后续研究需要采用微流成像技术对亚可见颗粒进行表征和稳定性研究。同样研究冻融条件对病毒载体稳定性影响，美国堪萨斯大学疫苗分析和制剂中心科学家（Vineet Gupta，2022，Journal of Virological Methods）研究了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）载体稳定性，使用TEM、NTA和MFI三种互补的病毒颗粒表征技术研究病毒载体在冻融应激下稳定性。4种不同制剂配方（Form 1-4）在0、3和6个冻融循环条件下亚可见颗粒变化，研究冻融对病毒载体稳定性影响。参考下图，结果证明了通过MFI可检测到样本中存在大量的亚可见微粒。揭示某些制剂（制剂F1和F3）病毒载体亚可见颗粒浓度与病毒载体滴度损失之间存在负相关，制剂配方2和4没有变化。与上述研究类似，Kumru等2015年观察到在冻融循环时，特定配方中溶瘤单纯疱疹病毒1的体外效力值和亚可见颗粒浓度之间呈现负相关。基于多项研究，不同制剂配方中观察到结果可能有所不同，所以在评估病毒感染能力和稳定性时，需要同步进行亚可见颗粒研究。综上所述，基因治疗产品在研发、生产、存储等多个工艺过程中需要持续监测样本中颗粒情况，从早期到晚期开发阶段都需要监测颗粒的动态变化过程，探索研究病毒聚集体和颗粒产生的原因。可采用多种不同分析检测技术联合使用，针对纳米级和微粒级颗粒进行全范围覆盖。特别是参考中美药典对不溶性颗粒检测规定，借鉴生物大分子蛋白质药物颗粒分析经验，不同方法优势互补，采用光阻法、显微计数法和微流成像颗粒分析方法（MFI）对亚可见微粒进行深入研究，分析基因治疗原料药和药品中颗粒形成原因，可用于优化病毒载体生产和纯化工艺、筛选合适制剂配方和存储条件，提高产品质量稳定性和安全性，保证产品疗效。索取资料请扫上方二维码参考文献：Alexandra Roesch, Sarah Zolls, et al. Particles in Biopharmaceutical Formulations, Part 2: An Update on Analytical Techniques and Applications for Therapeutic Proteins, Viruses, Vaccines and Cells. Journal of Pharmaceutical Sciences(2021) 1−18于雷，裴德宁等. 基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性研究. 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2020,40(1)Andrew D.Tustian, Hanne Bak. Assessment of quality attributes for adeno‐associated viral vectors. Biotechnol Bioeng. 2021;1–18.United States Pharmacopeia .Subvisible particulate matter in therapeutic protein injections.  . Particulate Matter in Injections. . Particulate Matter in ophthalmic solution. . Measurement of subvisible particulate matter in therapeutic protein injections. . Methods for the determination of subvisible particulate matter. Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention;2020年版药典，0903 不溶性微粒检查法Abhiram Arunkumar, Nripen Singh. Ultrafiltration behavior of recombinant adeno associated viral vectors used in gene therapy. Journal of Membrane Science, volume 620,2021Jared S. Bee, Yu (Zoe) Zhang, et al. Impact of Time Out of Intended Storage and Freeze-thaw Rates on the Stability of Adeno-associated Virus 8 and 9. Journal of Pharmaceutical Sciences (2022) 1−8 Vineet Gupta, Lorena R. Antunez, et al. Development of a high-throughput RT-PCR based viral infectivity assay for monitoring the stability of a replicating recombinant Lymphocytic Choriomeningitis viral vector. Journal of Virological Methods 301 (2022) 114440

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面对生物制药的百“抗”齐放，细胞和基因治疗的如火如荼，外泌体仿佛一匹突出重围的黑马吸引着来自资本、科研、临床转化和产业化的目光。在本文中，您将了解到外泌体基本信息、外泌体有多火、该赛道头部玩家、外泌体鉴定和表征先进技术，全自动Digital Western Blot如何助力头部玩家产业转化。什么是外泌体？所有细胞，在正常生理和病理情况下都分泌细胞外囊泡Extracellular Vesicles（EVs）。广义的细胞外囊泡可分为两类，微（囊）泡Ectosomes和外泌体Exosomes。外泌体是由磷脂双分子层构成的细胞外囊泡，其直径约30~120nm，平均直径约100nm。外泌体内部包裹着丰富内容，包括蛋白质、RNA、DNA、脂质、氨基酸、代谢产物甚至病毒。外泌体表面磷脂双分子膜上，含有常见表面标志物四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、整合素、免疫调节分子等等。外泌体几乎可以在所有体液（血液、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、精液）中找到，可通过循环系统送达到其他组织和细胞，产生调控作用，参与细胞代谢、肿瘤发生、免疫调节、神经系统疾病等生理和病理活动。因此，广泛地被应用于Biomarker研究、药物治疗载体、疾病早期筛查和诊断。外泌体有多火？图片来源于网络外泌体相关的研究和产业化近些年来非常火热，当然离不开诺贝尔奖的助力加持。2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予了来自美国的两位科学家詹姆斯·罗思曼和兰迪·谢克曼，以及德国科学家托马斯·祖德霍夫，以表彰他们从基因和机制层面发现和解答了细胞的囊泡运输调控奥秘。数据来源于：PubMed数据来源于：LetPub数据库PubMed历年发表与和外泌体相关的文献，呈现出指数增长。国家自然科学基金2021年中标项目，与外泌体相关的项目超过2000个，超过总体的12%。外泌体头部玩家图片来源于：Codiak官网外泌体治疗产业化最头部的玩家之一是美国Codiak BioSciences公司，成立于2015年。2021年在美国纳斯达克上市。在过去很长一段时间，外泌体的生产和提纯，都是阻碍外泌体向临床转化的最大障碍。在制造方面，Codiak发现了两种来源高度丰富的天然外泌体蛋白（PTGFRN和BASP1），这些膜上的蛋白可以将目标分子（细胞因子、抗体片段、RNA结合蛋白、疫苗抗原、Cas9和肿瘤坏死因子TNF家族、小分子药物等等）锚定在外泌体的外侧或内侧，实现药物高效递送。图片来源于：Codiak官网 Codiak作为头部玩家，目前有两款针对于肿瘤治疗产品进入到临床一期。exoIL-12，针对早期皮肤T细胞淋巴瘤；exoSTING，针对实体瘤；exoASO STAT6: 针对M2型巨噬细胞、肝癌、胰腺导管癌等，该产品计划于2022年推入临床一期。 工程化外泌体标志物鉴定&表征2021年，来自Codiak公司的科学家，在Molecular Therapy（IF：11.45）中发表文章：A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties.使用ProteinSimple全自动Digital Western Blot对外泌体进行表征，检测如下蛋白：外泌体标志物：传统标志物四次穿膜蛋白（CD9、CD63、CD81）和SDCBP大低聚复合物蛋白：LGALS3BP内质网蛋白：CANX工程化外泌体作为药物递送载体，目的蛋白检测2022年2月，Codiak公司的科学家在Science Advances（IF：14.14）期刊中发表了其外泌体候选产品exoASO-STAT6药物临床前数据。早在2021年的美国基因与细胞治疗协会的年度会议中，Codiak公司的科学家就曾分享其工程化外泌体平台管线之一，exoASO-STAT6候选药物，利用在工程化外泌体表面携带特定反义寡核苷酸ASO，将其递送到高度免疫抑制型的巨噬细胞M2中，降低免疫抑制转录因子STAT6表达，激活巨噬细胞，促进抗肿瘤免疫反应，重点针对肝癌、胰腺癌、结直肠癌疾病的治疗。科学家利用全自动Digital Western Blot检测带有ASO工程化外泌体、free STAT6 ASO、exoASO Scramble和阴性对照，24小时培养人、小鼠和食蟹猴来源的M2巨噬细胞STAT6蛋白表达。exoASO-STAT6可显著抑制STAT6表达。 外泌体，下一代药物递送平台？外泌体作为下一代药物递送平台展现出诸多优势（可通过血脑屏障、低免疫原性、高靶向性），也被称为无细胞的细胞治疗（Cell-free cell therapy）。然而，外泌体研究和产业化也面临外泌体异质性的挑战，包括大小异质性，内容物异质性，功能和来源异质性。需要一系列的先进技术对外泌体进行鉴定和表征。全自动Digital WB助力您外泌体研究和产业转化无需制胶    无需转膜    精确重复   真正定量超微量：每个样品仅需3ul高灵敏：化学发光和荧光模式检测全自动&高通量：24个样品检测仅需3h可总蛋白归一化，可绝对定量扫描下方二维码，获取ProteinSimple全自动Digital WB外泌体解决方案参考文献：1. R. Kalluri, V. S. LeBleu, The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science 367, eaau6977 (2020).2. K. Dooley, R. E. McConnell, K. Xu, et al., A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties. Mol. Ther. 29, 1729–1743 (2021).3. Kamerkar, Sushrut et al., Exosome-mediated genetic reprogramming of tumor-associated macrophages by exoASO-STAT6 leads to potent monotherapy antitumor activity. Science advances vol. 8,7 (2022).4. Herrmann, Inge Katrin et al., Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nature nanotechnology vol. 16,7 (2021). 关于我们：ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们：地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

2021·中国学者2021.09大活动发起2021.12道提交作品21至参与投票环节22000+简累计投票次数      自2021年9月1日“ProteinSimple 2021中国学者研究奖”活动发起，历经3个月的作品收集，21份作品共收到累计超过22000+的投票！      ProteinSimple秉承大道至简:      全自动Digital Western Blot系列产品（Jess、Wes、Sally Sue、Peggy Sue、2021新品Abby）以其超微量3ul上样量，全自动高通量检测，极佳的重复性，快速3小时出全膜结果，数据完整性高的特点，深受客户的喜爱和肯定！      2022元旦伊始，按文章影响因子（IF）权重60%，网络投票评选权重40%评比，恭喜以下中国学者，在“ProteinSimple 2021中国学者研究奖”活动中获奖！绝带佳人：小米背包“全自动Digital Western Blot加速了实验进展，缩短了实验进程。”李美芽老师 · 浙江中医药大学“Digital WB缩短的WB的检测时间，并且条带更好看。”周玲老师 · 太原市中心医院“准确地反映了研究靶点的作用机制。”陈永老师 · 深圳市人民医院“Digital WB相比于传统的Western blot，操作简便，误差小，结果更加可靠，图片表达更加有说服力，在投稿过程中得到了审稿人的一致好评。”焦海燕老师 · 北京中医药大学“更加快捷，高效并且准确率高。”常文娟老师 · 太原市中心医院“ Digital WB全程自动化，高效精准，有效节省了人力和时间，实现了大样本、多个浓度的实验体系，对我们快速准确的确定实验条件提供了有力保障。”刘瑛老师 · 广西中医药研究院衣带渐宽：SKG颈部按摩仪“用Digital WB检测比传统WB更快速、准确，提高了实验效率。”潘洁莉老师 · 浙江中医药大学中医药科学院“Digital WB可对羰基化蛋白质进行可视化检测。”胡一晨老师 · 成都大学“操作方便，数据可靠。”杜忠君老师 · 山东第一医科大学“操作方便简洁，极大缩短了western-blot实验的时间，提高了实验效率。”曹越老师 · 太原市中心医院“减少蛋白提取、上样量及抗体的用量，可以同时检测24个样品，缩短了实验时间，比传统WB更简单，此方法灵敏度高，用传统方法杂交不出来的蛋白，用此方法可以检测到目标蛋白。”温莉娴老师 · 华中农业大学 世带相传：Beats无线降噪耳机“操作简便，实验周期短，加快结果产出速度；结果清晰，重现性高；节省样本，节省抗体。”胡帅帅老师 · 扬州大学“Digital WB有助于解决稀缺样品（类器官）中蛋白质表达检测的问题，推动研究深入到干细胞水平，助力分子机制解析。”周加义老师 · 华南农业大学动物科学学院“更加精准快速且用量少的进行了蛋白水平的检测。”杨舒雅老师 · 空军军医大学“所用的NPC是原代细胞，获得细胞量较少，Digital WB可以让我们利用很少的样本量进行多次重复实验，大大提高了实验效率。”杨异凤老师 · 上海科技大学披星带月：华为手表“样本量小，速度快，一周之内拿到所有数据。”余青桐老师 · 江苏大学药学院“少量原代细胞即可检测多个蛋白。”段红霞老师 · 中科院生物物理研究所“快速、灵敏。”梁男男老师 · 太原市中心医院绝带双骄：华为手机“病人和正常人晶状体上皮细胞材料的获取是白内障机制研究的一大难点，在病人白内障手术中我们能获得的也是非常小的一小块囊膜，材料有限无法完成单个样本的普通WB。Digital WB技术可以让我们通过少量的蛋白样本获取大量的实验结果，并且可以分析不同个体之间的差异，准确性也得到了极大的提升。”王玲老师 · 中山大学中山眼科中心“Digital WB节约实验时间成本，节约了样本量。”周锡红老师 · 中国科学院亚热带农业生态研究所一带天骄：华为电脑“快速、简便，特别适用于珍贵微量样本。”田颖老师 · 中国科学院过程工程研究所，首都医科大学附属北京朝阳医院致敬中国学者      2022元旦伊始，我们带着对崭新一年的美好期许重新出发。祝福我们所有的科研工作者，在新的一年，从工作中得到乐趣，试验顺利！

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