核酸合成，我们会聊些什么？

今天我们就针对合成环节跟大家一起分享在此过程中大家比较关心的一些问题：

问题一：目前常用的核酸合成方法是采用固相亚磷酰胺三酯法（简称固相合成），完整的合成步骤需要经过脱保护，耦合，氧化，盖帽等环节，但是有的客户在氧化环节使用硫代进行替代，是否硫代化的结果要优于氧化还是有其他方面的考虑？

早期的合成实验是需要经过脱保护-耦合-氧化-盖帽等环节。研究发现这种合成方法出来的药物在体内的半衰期比较短，将氧化环节换成硫代之后，核酸药物在体内的半衰期大大延长。目前核苷酸的合成实验大多数采用硫代替代氧化。也就是说目前的主流合成步骤是：脱保护-耦合-硫代-盖帽四步，但是也有部分客户采用氧化+硫代相结合的方式进行。

问题二：核酸合成过程中会涉及到合成时间，耦合效率，物料消耗等情况，那么我们在考虑一台合成仪设备的性能时，我们更应该关注哪个核心指标？

从实际使用人员的角度来考虑的话，耦合效率是这几个指标中最为核心的要素。耦合效率的高低可以通过序列设计等环节进行控制，当然在合成过程中对于其他因素的控制也至关重要，比如合成环境温湿度，脱保护时间，耦合时间等也都会影响到最终的耦合效率。关于物料消耗情况，一般是在满足特定耦合效率的前提下会去考虑的因素，因为我们都知道核酸合成物料相较于其他合成试验比较贵。

问题三：在核酸合成过程中，是否可以通过软件图谱进行判定耦合的效果情况，比如说通过UV的图谱和电导值等直观的进行判断？如果耦合效率低于预定的数值，那么软件本身是否有对应的响应机制？

在核酸合成过程中可以通过对脱保护环节的峰面积进行计算从而去判定耦合效率的高低。当然对于有经验的合成人员，通过多次试验结果与电导值的比对情况得出一定的关联性，比如在耦合过程中的电导值维持在1200~1300mS/cm时通常代表耦合效果不错,当然这个数值也不固定，也跟实验工艺相关数据相关，也有可能电导值在800~900mS/cm时耦合效率也比较好，电导值只能作为经验参数，不可以直接作为判断指标。

问题四：有的公司宣传合成序列长度在20~60之间，那么在实际合成的过程中药企会去选择用接近60个碱基去做合成吗，合成的难度以及后续的杂质等处理是否会更加复杂；其次，在选取固相载体的时候有哪些品牌可以做推荐，对于固相载体的选择，需要考虑哪些因素？

在有机合成中，我们都知道如果需要经过多步反应才能得到最终产物，那么产物的得率不会很高，其次对于反应过程的控制随着反应步数的增加而越发困难。这也是为什么部分核酸合成仪能够合成接近60个序列的长度，但是药企一般不会去顶格合成，还需要去考虑合成的难度以及后续粗品的纯度等问题。目前市面上比较主流的序列长度是在20~30个碱基序列长度之间，药企会综合考虑合成的难度以及成本等因素做出一定程度的优化，确保投入产出比最大化。

对于合成过程中固相载体的选择问题，主要需要考虑载体的载量和膨胀系数。载体的载量涉及到合成规模的问题，载体膨胀系数的大小会影响到合成过程中柱体积的变化，其本身数值也一定程度上反应了载体本身的性能。

问题五：核酸合成得到的粗制品需要进一步进行纯化，那么在选择纯化设备的时候是选择中低压设备还是高压设备进行纯化呢，这里有什么需要注意的，设备的选取的依据是什么？

核苷酸纯化是选择高压还是中低压设备是依据核苷酸序列来定的。普通的DNA、RNA或者修饰过的碱基序列一般会采用离子交换树脂就可以了。如果序列3’端或者5’增加了PEG或者其他递送系统（LNP脂质纳米颗粒），可能就需要使用高压柱来进行纯化分离，此时需要使用有机溶剂。所以，总体来讲没有固定的纯化方法，需要根据碱基序列的特点来选择分离纯化的方式（选择中低压或者高压设备）。