2023/07/20 16:58
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超高分辨活细胞荧光红外显微成像系统
型号: mIRage-LS
产地: 美国
品牌: PSC
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方案详情:
从头脂肪生成(DNL)是脂肪和肝脏组织产生脂质代谢的关键过程。该途径的失调与肥胖、非酒精性脂肪性肝病和II型糖尿病密切相关。但是DNL在细胞内的研究非常困难,常规的脂质染料缺乏特异性,抗体和小分子染料很难特异性标记这些脂质体。虽然目前可以使用葡萄糖基代谢探针等同位素来标记这些物质,但是很难具备亚微米级别的空间分辨率,同时无法对细胞内部进行成像,也不能提供脂质的特性和其他环境生物分子的组成信息。这些都极大的限制了脂质体的相关研究,尤其是活细胞内脂质代谢的研究。
美国PSC公司研发的全新非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage的出现为上述问题提供了新的解决方案。mIRage采用新型光学光热诱导共振(O-PTIR)技术,不仅具备传统FTIR的特性,可以对物质的分子结构进行解析,还克服了传统红外空间分辨率不足,无法精细表征细胞内部结构的问题,其分辨高达500 nm,可在亚微米尺度上实现对细胞结构的观测,与光学显微镜基本相同,有助于理解亚细胞器结构。设备光热膨胀技术能够在不接触样品的情况下进行检测,大幅度简化了样品制备过程,全程对样品无污染,并且没有米氏散射问题,可在不平整的表面上取得良好的谱线。而其特有的探测机制使得mIRage能够很大限度上避免水的干扰,真正实现活细胞的探测。
近期,耶鲁大学成功安装了非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage,并在活细胞脂肪代谢研究中取得了新的进展!
在该研究中,Sydney O. Shuster等人使用非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage观测DNL在活细胞和固定脂肪细胞中的分布。作者认为在DNL、葡萄糖或其他碳水化合物代谢形成游离脂肪酸(FFA) 和甘油三酯的途径中,首先形成糖酵解丙酮酸,后被带进线粒体,通过TCA循环转化为柠檬酸盐。柠檬酸盐再转化为酰基辅酶a和丙二酰辅酶a用于脂肪酸合成并产生甘油三酯,然后储存在脂滴中作为能量储备。通过mIRage对固定的3T3-L1细胞的成像分析,作者通过脂肪代表性的酯羰基振动1747cm-1成功定位到细胞中的大部分脂质、甘油三酯的分布,并通过1655和1541cm-1处的酰胺-I和酰胺-II带定位蛋白质。
DNL的代谢途径与固定细胞的明场与红外脂质体与蛋白的热图成像
为了跟踪葡萄糖代谢和DNL,作者给细胞喂入13C葡萄糖来代替12C葡萄糖。因为它的分子振动模式与所涉及的原子质量增加导致红外波数的红移,通过检测发现羰基的拉伸震动红移了44 cm-1。有趣的是1239 cm-1的波段本身不能明确地区分给C-O-C或PO2 ,而未标记细胞中的不对称拉伸在13C标记后时消失,这可能是红移到相邻的峰中导致的。这表明该峰值的主要来源是C-O-C 甘油三酯和/或胆固醇酯的不对称拉伸震动,并且磷脂不会显著地干扰3T3-L1脂肪细胞中的信号。而蛋白信号在这一过程中没有变化,表明蛋白质不会随着13C葡萄糖的供给而偏移。与之相对,CH3和CH2相关的1450cm-1波段蛋白质和脂类的变形和伸展震动的出峰不变。这可能是由于形成的甘油三酯来自游离脂肪酸和甘油的酯化。虽然两者都是 FFA和甘油由葡萄糖通过糖酵解产生,但它们以不同的速度产生和回收,影响着这些波段的移动速率。
进一步对加入13C葡萄糖24、48和72小时后的细胞进行检测,结果显示平均单细胞13C/12C比率在测试期间(72小时)持续增加,最终比率为0.54±0.14。其中大部分的13C转化成甘油三酯,并且DNL在空间上也是异质的。
对不同时间点固定的细胞进行观测和对比其中的DNL含量
在活细胞实验中,也取得了和固定细胞类似的结果,并且活细胞的光谱图像比固定的更清晰,细胞和与蛋白质酰胺-I信号重叠较少证明了这项技术甚至可以检测到活细胞中甘油三酯到12C甘油三酯13C比率的微小差异。
活细胞的DNL含量观测
综上所述,非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统——mIRage在细胞成像中具有优异的潜力,可以提供脂质种类的信息,提供对低浓度物质如游离脂肪酸的定位,并允许对每个样品的脂质和蛋白质光谱特征进行全面位置光谱分析,并且能够应用长时间观测。这项技术未来将可以用于绘制细胞系和细胞内DNL的比率、疾病状态,进一步揭示DNL 导致代谢紊乱的原因。在评估针对调节DNL和治疗疾病的药物方面提供诸多帮助。
参考文献:
Spatiotemporal Heterogeneity of De Novo Lipogenesis in Fixed and Living Single Cells. J. Phys. Chem. B 2023, 127, 2918−2926
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