【飞诺美色谱】ADC药物的DAR值测定---反相色谱法

概述

小分子毒素抗体比DAR（drug-to-antibody ratio）

是ADC药物独特的重要质量属性，它代表抗体偶联小分

子毒性药物的平均数量。

DAR值分析常见的模式为HIC，该模式下根据分子

疏水性逐渐增加的顺序洗脱。荷载小分子药物最多的分

子由于疏水性最强最后洗脱，分离过程类似于反相色谱，

但是随着ADC药物的payload不断发展，近期科研工作

者发现对于偶联较强亲水性payload的ADC药物而言，

不同荷载分子之间的疏水性差异不是特别明显，HIC模

式下无法很好的分离不同载药数量的ADC分子。

此时反相色谱在就成为一种适合的替代方案，该方

法特别适合基于半胱氨酸偶联的ADC。通过对ADC药物

进行还原，使抗体还原为轻链和重链，含不同数量小分

子载药数的轻链和重链依据载药数量从少到多依次洗脱。

再通过计算各轻、重链的峰面积百分比，并结合每个峰

偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值。

Trastuzumab deruxtecan（DS-8201；ENHERTU®)

是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型HER2靶向

ADC。Deruxtecan是毒性药物DX-8951 的衍生物 (Dxd)

和连接子马来酰亚胺-GGFG 肽的偶联物，是一种较为

亲水性的payload。

本应用使用Biozen 的400A孔径的WidePore C4色谱

柱对 DTT还原后的Trastuzumab- deruxtecan供试品进行

分析，并计算其平均DAR值。

关键词

平均DAR值；DS-8201；反相；Biozen WidePore C4；

BioTi；核壳柱

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

三氟乙酸，乙腈为色谱纯，屈臣氏蒸馏水

3.1.3样品

Trastuzumab- deruxtecan对照品购自第一三

共，DAR值为8。用纯水稀释为浓度为1.0

mg/mL;

Trastuzumab- deruxtecan供试品，由客户慷慨

赠送，先用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;再用

1M DTT还原后上样。

Trastuzumab购自MCE；先用纯水稀释为浓度为1.0

mg/mL;再用1M DTT还原后上样。

3.2色谱条件

色谱柱：Biozen WidePore C4（2.6um，400A

150*4.6mm）；P/N: 00F-4786-E0；

流动相A：0.1%TFA水；

流动相B：0.1%TFA乙腈；

流 速：0.5 mL/min；

柱 温：60 ℃；

波 长：215nm；

进样量：10 μL

梯度程序见表2：

3.3结果与讨论

通过对 Trastuzumab- deruxtecan 供试品

Trastuzumab单抗和Trastuzumab- deruxtecan对照品

进行还原（100ug蛋白中加入5uL 1M DTT，37°C分别

孵育半小时和一小时），我们可以在反相色谱上通

过梯度优化，清晰的分离轻链和重链以及荷载不同

小分子数量的轻重链。

通过对峰面积进行加权计算，我们可以计算得供试

品的平均DAR值为3.98。

结论

在本应用使用Biozen 的400A孔径的WidePore C4

色谱柱对 DTT还原后的Trastuzumab- deruxtecan供试

品进行DAR值分析。该柱采用核壳技术结合丁基的键

合相，可以大幅减少蛋白与固定相的次级作用，改

善蛋白回收率，峰形和残留的问题，三键键合技术

的C4固定相能够耐受90度的高温；Bio Ti生物惰性的

钛合金柱硬件也最大程度的减少了对生物基质样品

的干扰，保证分析结果的稳健可靠。