【飞诺美色谱】不同厂家色谱柱基于肽图分析的对比报告

概述

肽图分析是生物医药蛋白表征中的一个关键工作流 程，对于解析蛋白质的初级氨基酸结构至关重要。反相 高效液相色谱已成为多肽，蛋白质分析和表征的标准方 法，尤其是分析治疗性药物表征。通过反相色谱分析蛋 白质裂解后的肽段能够获得蛋白质的大量信息。通过比 较表达蛋白与参照标准蛋白的肽图能够得出蛋白纯度和 表达的准确性。艾杰尔飞诺美Biozen系列PS-C18和XB-C18分析色谱柱专为改善多肽分离和肽图分析应用而设 计，色谱柱分别采用表面多孔技术和核壳技术，能够实 现复杂多肽混合物的快速有效分离，而且采用特殊的TI 合金技术，能够减少样品残留，提高灵敏度回收率。本 应用选择了市面上专门针对肽图分析的4款色谱柱进行 对比，以期为客户提供更多选择方案。

关键词

肽图；Biozen；Waters；Agilent

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

高效液相色谱：Thermo U3000；

3.1.2试剂材料

三氟乙酸（TFA）、乙腈、盐酸胍、二硫苏糖 醇、碘乙酰胺为色谱纯；碳酸氢铵为分析纯； 屈臣氏蒸馏水

10kD超滤管，Sartorious，PN：VN01H02

3.1.3样品

英夫利昔、利妥昔购自欧洲药典标准品， Herceptin由客户提供，并根据制造商的使用说 明进行储存。

3.1.3样品前处理过程

⚫ 取30-100 μg蛋白样品溶液置于离心管中， 加入3 µL 1M的二硫苏糖醇（溶于7M盐酸 胍）溶液，55°反应30min，之后再加入8 µL的1M碘乙酰胺（溶于7M盐酸胍）溶液， 室温避光反应30min。

⚫ 将还原烷基化后的蛋白溶液转移到10kD的 超滤管中，14000g离心15min，弃掉溶 液。

⚫ 再加入100 µL盐酸胍溶液，离心，弃掉溶 液。

⚫ 加入100 µL 50mM碳酸氢铵溶液，离心， 弃掉溶液，重复2次。

⚫ 加入胰酶（溶于50mM碳酸氢铵中）（按照 胰酶:肽段w：w=1：50），并使用50mM碳 酸氢铵溶液补足体积至100 µL，酶解4-6h （或过夜），离心，收集溶液于新的收集 管中，加入5µL 10% TFA溶液终止反应。

3.2仪器检测条件

3.2.1色谱条件

色谱柱1： Biozen Peptide XB-C18 （2.1×150mm, 1.7μm, 100Å）；P/N: 00F- 4474-AN

色谱柱2： Biozen Peptide PS-C18 （2.1×150mm, 1.6μm, 100Å）；P/N: 00F- 4470-AN

色谱柱3： AdvanceBio Peptide Plus （2.1×150mm, 2.7μm, 100Å）；P/N: 695775- 949

色谱柱4： ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 （2.1×150mm, 1.7μm, 300Å）；P/N: 186003687

流动相：A: 0.1% TFA水

B: 0.1% TFA乙腈

流 速：0.2 mL/min；

波 长：214nm

柱 温：50 ℃；

进样量：10μL；

梯度：

3.3结果与讨论

4款色谱柱进行对比，从图中可以看出Biozen系列

的两根色谱柱和Waters出峰类似，与Agilent相比差

异比较大，可能原因是Agilent保留弱。

3.3.1 Herceptin结果

3.3.2 英夫利昔结果

图3 利妥昔结果图谱（红色：Biozen PS C18 黑色：Biozen XB C18Agilent ：蓝色 Waters：棕色）

结论

4根色谱柱进行对比，Biozen系列的两根色谱柱 和Waters出峰类似，与Agilent相比差异比较大。出 峰类似的3根色谱柱，不同片段分离度有所差异，不 能简单判定优劣。可根据具体需求选择相应色谱 柱。