【飞诺美色谱】ADC药物中的游离小分子测定-液相色谱法

概述

ADC 是 将 单 克 隆 抗 体 药 物 （ Monoclonal antibodies, mAbs）的高特异性和小分子化学药物的强细胞毒性相结合的药物，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用。一般而言，ADC药物由抗体（Antibody或mAb）、 连接子（Linker）、细胞毒性药物（Cytotoxin，或称有效荷载（Payload））三个部分组成：通过mAb将药物输送至目标肿瘤细胞，使ACD获得高度的靶向性；Linker负责连接抗体和细胞毒性有效荷载；Payload负责杀伤肿瘤细胞。

Trastuzumab deruxtecan（DS-8201；ENHERTU®) 是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型HER2靶向ADC。 Deruxtecan是毒性药物DX-8951 的衍生物 (Dxd)和连接子马来酰亚胺-GGFG 肽的偶联物。在ADC偶联工艺中， 多余的Deruxtecan会被除去。但是可能仍有微量的残留。此外，在药物的存储过程中，Deruxtecan也可能会从 ADC是脱落。而游离小分子毒素无靶向性，且毒性高，会影响 ADC 药物的安全性。因此，监测 ADC 药物中的游离小分子毒素的含量非常重要。

目前反相色谱法测定游离小分子的常规方法是在ADC药物中加入有机溶剂对蛋白进行沉淀，取上清液进行分析，通过外标法进行小分子定量分析。这种方法的缺点在于：游离小分子浓度很低，进一步稀释样品影响检出灵敏度。而本文选取了一款大孔径核壳型填料的低吸附反相C4柱，样品不沉淀直接进样，游离小分子和ADC药物可以实现良好的分离。并且大孔径核壳型C4色谱柱对于蛋白的吸附低，蛋白不易残留。

关键词

ADC；游离小分子毒素；RP-HPLC；核壳柱；Biozen Widepore C4

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

实验用水、乙腈、异丙醇、三氟乙酸均为色谱级。

3.1.3样品

Trastuzumab- deruxtecan样品为客户提供，平均DAR值约为4。浓度为1.0 mg/mL;

Trastuzumab- deruxtecan标准品购自第一三共。用纯水稀释为1mg/mL。

Deruxtecan浓度为10.34mg/mL，用50%乙腈逐级稀释。

3.2色谱条件

色谱柱： Biozen Widepore C4（4.6×50mm, 2.6μm, 400Å）；P/N:00B-4786-E0

流动相A相：0.1%三氟乙酸水；

流动相B相：0.1%三氟乙酸乙腈：异丙醇（1:1）；

流 速：0.8 mL/min；

柱 温：50 ℃；

波 长：215nm；

进样量：2 μL；

梯度程序见表2：

表2. 梯度条件

3.3结果与讨论

3.3.1 色谱柱的选择

本文考察了核壳型反相C4和C8柱，发现Deruxtecan和ADC的分离度在C4柱上更好，且Deruxtecan的峰形对称性也更好。而ADC在短柱上的响应比长柱更高。所以最终选择了Biozen Widepore C4的50mm短柱。

3.3.2 Deruxtecan 的峰形

取1.0mg/mL的Deruxtecan稀释液0.2uL上样，上样量约为200ng，可以看到Deruxtecan的峰型是非常尖锐的，主峰不对称度为0.94，塔板数59817。 主峰前可以观察到两个小峰，推测分别为linker 和payload。

3.3.3 色谱条件的选择

梯度有机相比例从10%起始，以4%/min升至50%后再快速升至90%，然后回到10%平衡，总时长20min。以高比例水相起始和平衡主要考虑ADC样品中可能含有水溶性的辅料和盐；有机相上升至90%主要考虑偶联过程中，可能引入的疏水性杂质的残留。

一般反相色谱柱分析抗体类蛋白时所使用的柱温在70℃或更高，但考虑到Deruxtecan的稳定性，本文柱温设置为50 ℃。发现这种核壳型的C4 色谱柱上，ADC不需要高柱温就可以出峰。

该ADC样品为工艺研究的样品，其中可以检测出其中含有游离的Deruxtecan，按照外标法可以计算得到游

离小分子的含量约为0.38%。

3.3.4 不同上样量Deruxtecan的面积对比

分别取Deruxtecan稀释液按照上样量200ng，10ng，1ng进样分析，得到的峰面别为9.3417、0.4580、0.0543。当时上样量为1ng时，Deruxtecan的S/N为11.0，达到S/N>10，可以近似认为该点为LOQ。

3.3.5 Deruxtecan的进样残留

在进样1mg/mL的Deruxtecan溶液0.2uL后，紧接着进Confidential - Company Proprietary 样0.2uL纯水做为空白对照，来测试进进样残留的情况。空白样品中测得Deruxtecan的峰面积约为前一针峰面积的0.3%。

结论

在本应用使用了Biozen Widepore C4 400Å 2.6μm, 4.6×50mm的色谱柱，对于这种2.6um核壳型的填料，可以同时兼容HPLC和UPLC的平台。 当代表色谱柱分离性能的L/dP保持一致的前提下，只需要重新选择不同仪器平台适合的内径及设置配套的流速，使得色谱柱获得一致的线速度的情况下，不同的仪器平台上可以使用相同的流动相梯度条件，不需要二次开发，可以节约方法开发人员的时间。

该方法不需要对ADC样品进行蛋白沉淀或者提取，可以直接进样，方法有效简便。

在该应用中，能够有效的分离ADC药物中的游离小分子和主成分。并且因为大孔径核壳型填料和C4固定相带来的低吸附的性能和尖锐的峰型，可以使得检测的灵敏度较高，可以满足实际分析中的应用要求。